2. Schadelijk genproduct

Definitie schadelijk genproduct

De Regeling ggo geeft onder artikel 2 de volgende definitie voor een schadelijk genproduct:

• een genproduct dat een mogelijk toxische, carcinogene, allergene, pathogene of immuun-modulerende eigenschap heeft, dan wel
• een genproduct dat kan bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal, dan wel
• een genproduct dat tot een antibioticumresistentie kan leiden waardoor de toepassing van medicijnen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar wordt gebracht.

Risicobeoordeling van een potentieel schadelijk genproduct

Stap 1: mogelijke schadelijkheid van sequentie vaststellen

De functie van het genproduct en de (potentiele) schadelijkheid van het product moeten omschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

Stap 2: werkzaamheid in nieuwe gastheer vaststellen

Indien een potentieel schadelijke sequentie gekloneerd wordt in een gastheer geldt in principe, ervan uitgaande dat het schadelijke genproduct aanwezig is en werkzaam kan zijn in de gastheer, minimaal een ML-II inschaling. Het daadwerkelijk schadelijke effect moet echter nog bepaald worden en is onder andere afhankelijk van de genetische en fysiologische context van de gastheer waarin de sequentie wordt toegepast.

Factoren die behulpzaam kunnen zijn bij het vaststellen of een potentieel schadelijk genproduct in de context van de gastheer ook als schadelijk beoordeeld moet worden, zijn bijvoorbeeld:

• Herkomst van de sequentie. Het maakt uit of een sequentie afkomstig is van een pathogeen dan wel apathogeen micro-organisme of een hoger organisme. Een apathogeen micro-organisme zal over het algemeen geen schadelijke sequenties bevatten. Terwijl bij het kloneren van sequenties uit een pathogeen micro-organisme altijd rekening gehouden moet worden met de aanwezigheid van schadelijke genproducten. Ook bij het kloneren van sequenties uit bepaalde hogere organismen, zoals een wesp of een kwal, moet er rekening gehouden worden met de aanwezigheid van schadelijke sequenties.
• De werkzaamheid van het genproduct in de fysiologische achtergrond van de gastheer. Bijvoorbeeld een virulentiefactor afkomstig uit een bepaalde pathogene bacterie zal alleen maar kunnen bijdragen aan de pathogene eigenschappen van de gastheer als de virulentiefactor past in het ‘leefpatroon’ van de gastheer. Of als een genproduct onderdeel is van een pathway, die leidt tot een schadelijk genproduct, dan moeten alle onderdelen van de pathway in het ggo aanwezig zijn om het schadelijke effect gerealiseerd te krijgen.
• De omstandigheden van de expressie van het genproduct. Bijvoorbeeld, voor een genproduct dat van nature weefselspecifiek tot expressie komt, kan het een groot verschil maken wanneer het tot expressie wordt gebracht onder controle van een promoter die in alle weefsels actief is. Voor een genproduct dat normaliter getimed of na inductie tot expressie komt kan het verschil maken of het onder controle staat van een constitutieve (continue aangeschakelde) promoter. Voor een genomische DNA sequentie afkomstig uit een eukaryoot donororganisme, waarin intronen aanwezig zijn, maakt het uit of de gastheer een prokaryoot of een eukaryoot is. In een prokaryote gastheer zal de sequentie mogelijk niet tot expressie komen, omdat intron splicing in deze gastheer niet kan plaatsvinden.
• De mate van expressie van het genproduct. De interpretatie van het risico van hoge expressie, of van onbalans van het natuurlijke expressie niveau, moet worden beoordeeld ten opzichte van het niveau van de expressie onder normale omstandigheden.
• Posttranscriptionele of posttranslationele modificatie. Sommige genproducten krijgen hun fysiologische werking, en daarmee ook hun potentieel schadelijke werking, pas na posttranslationele modificatie, of nadat ze geleid zijn naar het juiste celcompartiment.
• Interactie met subunits of cofactoren. Indien de schadelijke werking een samenspel is van subunits, is het van belang vast te stellen of deze subunits allen tesamen tot expressie worden gebracht en tot een schadelijk effect kunnen leiden.

Stap 3: schadelijkheid van het ggo voor mens en milieu vaststellen

Nadat is vastgesteld dat een schadelijk genproduct inderdaad werkzaam is in de context van de gastheer dient de schadelijkheid voor mens en milieu van het ggo nog bepaald te worden. Het effect van potentieel schadelijke genproducten kan namelijk ook beperkt zijn tot de gastheer, e.g. het genproduct heeft alleen een direct effect op de gastheer, maar is niet schadelijk voor mens of milieu. Bij het vaststellen van de schadelijkheid voor mens en milieu worden ook het verspreidingsrisico van het desbetreffende ggo en de mogelijke ernst van de effecten veroorzaakt door het schadelijke genproduct bij eventuele verspreiding meegewogen. Daarbij kan aangetekend worden dat deze stap in iedere risicoanalyse uitgevoerd moet worden, ook bij klonering van genproducten die niet onder de definitie van schadelijk genproduct vallen. Hoewel minder voor de hand liggend dan bij de toepassing van schadelijke genproducten kan niet op voorhand worden uitgesloten dat ook onschadelijke, of niet obligaat schadelijke genproducten de eigenschappen van een gastheer kunnen beïnvloeden, waardoor een schadelijk effect voor mens of milieu kan ontstaan.

Voorbeelden:

- Het tot expressie brengen van een toxine zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden vanwege het directe schadelijke effect, bijvoorbeeld het expresseren van een toxine in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II op grond van artikel 5.2.f. Indien men een van een toxine afgeleid deeltoxine tot expressie wil brengen, dan zijn er meerdere situaties denkbaar:

• De aanvrager heeft geen beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is. Er moet in de risicobeoordeling nog steeds van uitgegaan worden dat sprake is van een schadelijk genproduct. Inschaling: ML-II op grond van artikel 5.2.f.
• De aanvrager heeft de beschikking over experimentele gegevens, zoals bijvoorbeeld een LD50  waarde > 100 µg/kg, waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is voor vertebraten (zie de criteria COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) voor toxines CGM/050628-01). Inschaling ML-I, op grond van artikel 5.2.i, aangezien het deeltoxine aantoonbaar niet codeert voor een schadelijk genproduct.
• De aanvrager heeft niet de beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is, maar baseert dit op een theoretische onderbouwing. Inschaling ML-II op grond van artikel 5.2.f, waarbij men een 2.8 verzoek kan indienen voor inschaling op ML-I waarbij onderbouwd dient te worden dat dit deeltoxine geen schadelijke effecten heeft.

- Het tot expressie brengen van allergenen zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden, vanwege het directe schadelijke effect. Het expresseren van een allergeen in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II, op grond van artikel 5.2.f. Klonering van bepaalde allergenen in E. coli kan onder voorwaarden op ML-I plaatsvinden, bijvoorbeeld in de situatie dat het allergeen achter een induceerbare promoter gekloneerd is. In een dergelijk geval kan via een 2.8 verzoek om inschaling op ML-I niveau worden verzocht.

- De inschaling van oncogenen als schadelijk genproduct is sterk context-afhankelijk. Bij klonering in E. coli van een plasmide met een oncogen of bij transfectie van animale cellen met een oncogen bevattend plasmide, wordt het oncogen doorgaans als niet-schadelijk voor mens en milieu beschouwd, omdat het verspreidingsrisico van E. coli en animale cellen al zeer klein is en de kans dat hierdoor het schadelijke effect (tumorvorming) zal optreden verwaarloosbaar is, vanwege de verschillende stappen die voor tumorvorming (o.a. integratie van het oncogen in het genoom gevolgd door mutaties in andere oncogenen) nodig zijn. Dit betekent dus dat in deze context individuele oncogenen niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen (veelal) op ML-I kunnen worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i of 5.4.1.i. In de context van inschaling van pathogene micro-organismen, met name replicatiecompetente virussen, zal het potentieel schadelijke effect van het oncogen te allen tijde moeten worden meegewogen. Virussen hebben een groter verspreidingsrisico. Bovendien hebben oncogenen de potentie om de pathogeniteit van virussen te beïnvloeden. Klonering van oncogenen in virussen zal dus leiden tot een hogere standaard inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de oncogene donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

NB: Vele genetisch gemodificeerde cellijnen zijn geïmmortaliseerd met behulp van de immortaliserende eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A of hTERT. Cellijnen die op deze manier zijn geïmmortaliseerd en die vervaardigd zijn met behulp van muizen gammaretrovirussen of adenovirus kunnen via artikel 5.4.3.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.3.i (in geval van hTERT) direct op ML-II (zonder 2.8 verzoek) worden ingeschaald. Geïmmortaliseerde cellijnen vervaardigd met behulp van een tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentiviraal systeem of AAV kunnen via artikel 5.4.2.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.2.i (in geval van hTERT) direct op ML-I worden ingeschaald, vanwege de biologische inperking van de virale systemen hoeven deze inserties in de context van deze werkzaamheden niet als schadelijk te worden beschouwd. 

- Met schadelijke én immuunmodulerende genproducten worden genproducten bedoeld die direct een nadelige invloed hebben op het immuunsysteem van de natuurlijke en beoogde gastheren. Dat wil zeggen genproducten die het functioneren van het immuunsysteem stimuleren of die een immuunreactie onderdrukken en genproducten die daarnaast leiden tot een  verandering van tropisme of gastheerbereik of verhoogde pathogeniteit, transmissie of virulentie van de gastheer.  Voorbeeld: het muizen IL-4 gen (een gen coderend voor een immuunmodulerend cytokine) dat bij klonering in een muizenpokkenvirus tot een verhoogde virulentie leidt alsmede invloed heeft op het immuunsysteem van de muis. Klonering van immuunmodulerende eiwitten in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling, dus bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II op grond van artikel 5.4.3.i. Echter indien afdoende is onderbouwd dat de immuunmodulerende donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek te worden gedaan.
Of imuunmodulerende genproducten altijd leiden tot een schadelijk effect zal per casus moeten worden beoordeeld in de context van de activiteit waarin de sequentie wordt toegepast.  Voorbeeld: bij klonering in E. coli of bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen bevat dat codeert voor een immuunmodulerend genproduct, is het, evenals bij oncogenen, niet waarschijnlijk dat hierdoor een blijvend schadelijk effect voor mens en milieu zal optreden. Omdat in deze context de gastheren niet in staat zijn het immuunsysteem te beïnvloeden en bovendien brengt de sequentie op zichzelf  geen schadelijk effect teweeg. Dit betekent dat in deze context de immuunmodulerende genproducten niet als schadelijk hoeven worden beschouwd en deze handelingen dus op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.2.i of 5.4.1.i.  

- Pathogeniteitsfactoren. Bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen coderend voor een enkele pathogeniteitsfactor bevat, is het niet zeer waarschijnlijk dat hierdoor een schadelijk effect voor mens en milieu zal kunnen optreden. Dit betekent dus dat in deze context pathogeniteitsfactoren niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.4.1.i. Ook bij klonering in E. coli zal een individuele pathogeniteitsfactor, met name indien deze normaal gesproken deel uitmaakt van een pathway bestaande uit meerdere componenten, doorgaans niet tot een schadelijk effect kunnen leiden en kan deze via 5.2.i worden ingeschaald. Echter in geval van klonering van een individuele pathogeniteitsfactor die direct de apathogene eigenschappen van E. coli zou kunnen beïnvloeden (gedacht kan worden aan een individueel eiwit dat het tropisme van E. coli verandert of deze invasief maakt voor cellen) dient er via 5.2.f te worden ingeschaald. In de context van pathogene micro-organismen, zal het potentieel schadelijke effect te allen tijde moeten worden meegewogen. Klonering van pathogeniteitsfactoren in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de pathogeniteitsfactor in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

- Aggregerende eiwitten: een bijzondere categorie van schadelijke genproducten betreffen sequenties coderend voor aggregerende eiwitten met pathogene effecten zoals prionen, alpha-synucleine en tau.
Sequenties coderend voor prionen dienen te allen tijde als schadelijk genproduct te worden ingeschaald aangezien is aangetoond dat prionen infectieus en overdraagbaar zijn en een risico voor mens en milieu kunnen vormen.
Voor overige aggregerende eiwitten met (potentieel) pathogene effecten zoals alpha-synucleine,  amyloid‐β, tau, superoxide dismutase 1, huntingtin, TAR DNA‐binding protein‐43, serum amyloid A en apolipoprotein A‐II geldt dat er, anders dan bij prionen, tot op heden niet is aangetoond dat deze aggregerende eiwitten en de daarmee geassocieerde ziekten zich via een natuurlijke route van mens-op-mens kunnen verspreiden.
Echter, indien deze aggregerende eiwitten in combinatie met replicerende en zich verspreidende vectoren worden gebruikt kan verspreiding naar en blootstelling van derden aan een aggregerend eiwit met mogelijk sterk nadelige gevolgen niet worden uitgesloten. Daarom zullen in deze gevallen aanvullende inperkende maatregelen noodzakelijk zijn om de veiligheid van mens en milieu te waarborgen (zie ook CGM/170316-04).

De inschaling van sequenties coderend voor aggregerende eiwitten, uitgezonderd prionen, is derhalve context-afhankelijk:

• Klonering in E. coli K12 en expressie in animale cellen van sequenties coderend voor prionen, inschaling ML-II, op grond van respectievelijk artikel 5.2.f en 5.4.1.f.
• Klonering in E. coli K12 en expressie in animale cellen (zonder toepassing van virale vectoren) van sequenties coderend voor aggregerende eiwitten (uitgezonderd prionen), inschaling ML-I, op grond van respectievelijk artikel 5.2.i en 5.4.1.i.
• Activiteiten met muizen en ratten transgeen voor prionen en met cellen en weefsels van deze dieren kunnen niet via bijlage 5 worden ingeschaald. Hiertoe dient een 2.8 verzoek te worden ingediend.
• Activiteiten met muizen en ratten transgeen voor aggregerende eiwitten (uitgezonderd prionen) en met cellen en weefsels van deze dieren, inschaling respectievelijk D-I op grond van 5.6.1.a en ML-I op grond van 5.4.4.a.
• Activiteiten waarbij sequenties coderend voor aggregerende eiwitten als donorsequentie in replicatiecompetente virale vectoren worden toegepast dienen via 5.4.3.f te worden ingeschaald. Indien afdoende onderbouwd kan worden (bijvoorbeeld op grond van bestaande COGEM adviezen met soortgelijke virale vectoren en activiteiten) dat de donorsequentie in de context van de virale vector niet in een schadelijk effect resulteert kan direct via 5.4.3.f op ML-II worden ingeschaald in geval van een PG2 virus. Bij twijfel over de juiste inschaling (ML-III dan wel ML-II) dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.
• Voor activiteiten met andere gastheren (dan de hierboven genoemde) in combinatie met aggregerende eiwitten is het advies om eerst contact op te nemen met Bureau GGO genetisch gemodificeerd organisme (genetisch gemodificeerd organisme ) over de te volgen inschaling en procedure.

NB: voor de activiteiten met sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die op het laagste inperkingsniveau mogen plaatsvinden geldt dat in het kader van de ggo-regelgeving geen aanvullende veiligheidsmaatregelen noodzakelijk zijn anders dan eventueel weergeven in deel II van Bijlage 5 van de Regeling GGO. Vanuit ARBO Arbeidsomstandigheden (Arbeidsomstandigheden)-overwegingen moeten echter wel veiligheidsmaatregelen getroffen worden om laboratoriummedewerkers te beschermen, zoals vastgelegd in het Arbeidsomstandighedenbesluit. Dit is tevens het geval indien er geen sprake meer is van activiteiten met ggo’s, bijvoorbeeld na afdoding van de ggo’s, maar van werkzaamheden met (opgezuiverde) aggregerende eiwiten.

- Antibioticumresistentiegenen kunnen schadelijk zijn voor mens of milieu indien de toepassing van medicijnen hierdoor in gevaar wordt gebracht. Dit is doorgaans niet het geval voor kleinschalige handelingen met veelvuldig in de moleculaire biologie toegepaste antibioticum resistentie genen zoals ampicilline (bla), kanamycine en neomycine (npt-I/II) resistentie genen. Deze kunnen bij toepassing in E. coli als onschadelijk worden beschouwd en op ML-I worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i. Toepassing van antibioticum resistentie genen die coderen voor resistentie tegen klinisch relevante middelen (zoals bijvoorbeeld ESBLs en vancomycine resistentie genen) leiden wel tot een hogere inschaling (ML-II of hoger), op grond van artikel 5.2.f.

- Genproducten die kunnen bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal zijn bijvoorbeeld zelfoverdraagbare genetische elementen en transposons. Hierbij kunnen de volgende veelvoorkomende situaties worden onderscheiden:

• Bij klonering in E. coli K12 wordt een zelfoverdraagbaar genetisch element gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II op grond van artikel 5.2.f
• Bij klonering in E. coli K12 wordt een actief (prokaryoot of eukaryoot) transposon waarbij zich tussen de transposon uiteinden gekloneerd materiaal bevindt gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II op grond van artikel 5.2.f
• Dit geldt niet voor een inactief transposon, dat bijvoorbeeld zijn transposase heeft verloren. Inschaling bij klonering in E. coli K12, ML-I op grond van artikel 5.2.i
• Er zijn geen aanwijzingen dat toepassing van zelfoverdraagbare elementen en transposons in een plasmide vector in eukaryote cellen tot horizontale overdracht van genetisch materiaal kan leiden. Inschaling, ML-I op grond van artikel 5.4.1.i
• Klonering van een actief transposon in een pathogeen micro-organisme van klasse 2 kan op grond van artikel 5.3.f direct op ML-II plaatsvinden indien afdoende is onderbouwd dat het transposon in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert.

Ook genproducten die niet onder de definitie van een schadelijk genproduct vallen kunnen in een bepaalde context toch een schadelijk effect hebben. Hierbij kan gedacht worden aan sequenties en eiwitten die op zichzelf niet schadelijk zijn maar die wanneer geinsereerd in een micro-organisme het tropisme kunnen veranderen (in geval van virussen) of de invasiviteit voor animale cellen kunnen bevorderen (in geval van bacteriën) en daardoor in potentie de pathogeniteit kunnen beïnvloeden. Dergelijke sequenties kunnen bijvoorbeeld bij transfectie in animale cellen als niet schadelijk worden ingeschaald (ML-I, conform 5.4.1.i), terwijl deze in de context van een bacterie tot een hogere inschaling kunnen leiden (ML-II conform 5.2.f of ML-III conform 5.3.f). Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek te worden ingediend.

4. (On)gekarakteriseerde donorsequentie

Gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties

In de inschalingsartikelen van bijlage 5 wordt gesproken over gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties. In Bijlage 2, lijst A3 onder punt 1 wordt beschreven wanneer een sequentie in ieder geval als ongekarakteriseerd beschouwd moet worden.

Een sequentie wordt in ieder geval beschouwd als ongekarakteriseerd indien een of meerdere van de hierna genoemde gegevens ontbreken:

1. de herkomst en de aard van de sequenties;
2. de wijze waarop de insertie is geconstrueerd;
3. een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben.

Aandachtspunten bij de onderbouwing bedoeld onder c, zijn de functie en de relatieve posities van

• structurele genen,
• regulerende sequenties,
• synthetische sequenties,
• van transposons en provirussen afgeleide sequenties en
• sequenties die van belang zijn voor de replicatie in het genetisch gemodificeerde organisme.

a.     De herkomst en de aard van de sequenties

De herkomst, dus de donor waaruit de sequenties gekloneerd worden, moet bekend zijn en omschreven worden, ongeacht of het een hoger organisme of een micro-organisme betreft. Indien de donor een niet viraal (a)pathogeen (een bacterie, schimmel of parasiet) is, dan moet deze vermeld staan op bijlage 2, lijst A1 of op één van de lijsten van bijlage 4, lijst 4.2, 4.3 of 4.4. In geval van een viraal pathogeen moet deze vermeld staan op bijlage 4, lijst 4.1. Als het micro-organisme niet op één van de bijlagen vermeld staat, dan moet de gebruiker een artikel 2.8 verzoek doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen.
Verder moet de aard van de sequenties beschreven worden, hierbij gaat het om wat voor soort sequenties het betreft, is het bijvoorbeeld een genomische sequentie, een cDNA bank, een specifiek gen, een synthetische sequentie of een gedeelte van de coderende sequentie van een gen.

b.    de wijze waarop de insertie is geconstrueerd

De manier waarop de sequenties gekloneerd zijn of gaan worden moet omschreven worden, aangezien dit voor de inschaling bepalend kan zijn. Worden sequenties random gekloneerd uit bekende donoren of juist uit een pool van (on)bekende donoren? Wordt met aspecifieke primers gezocht of wordt met specifieke primers naar een specifiek gen gezocht en wordt uitsluitend dit specifieke gen gekloneerd? Worden uitsluitend korte sequenties (bijvoorbeeld domeinen of delen van genen) of ook langere sequenties (complete genen) gekloneerd?

c.     een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben

De functie(s) die een sequentie kan hebben, moet(en) beschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

Om in de risicobeoordeling een sequentie als gekarakteriseerd te kunnen beschouwen moet op nucleotide niveau vastgesteld zijn dat het daadwerkelijk de beoogde sequentie betreft en moet van deze sequentie beargumenteerd worden welke functie(s) de sequentie heeft. Het is dus van belang op te merken dat een fragment waarvan alleen de nucleotide sequentie is vastgesteld niet per definitie als gekarakteriseerd is te beschouwen. De gegevens over functie en herkomst moeten immers ook geleverd worden.

Vaststellen van de identiteit van een sequentie

Het vaststellen van de identiteit van de beoogde sequentie op nucleotide niveau kan op verschillende manieren uitgevoerd worden en is afhankelijk van het uitgangsmateriaal.

• Wanneer er random gekloneerd wordt, is er in eerste instantie altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties en moet er ingeschaald worden via a t/m e, daarbij rekening houdend met eventuele aanwezigheid van potentieel schadelijke genproducten en de wijze van klonering.
• Als er een cDNA bank gemaakt wordt in E. coli is er altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties. Vervolgens kan er op zoek gegaan worden naar specifieke sequenties waarvan de functie bekend is. Dit kan op verschillende manieren, afhankelijk van wat er al bekend is van de sequentie: met specifieke primers, door te sequencen, door restictie-enzym analyse, western blot of met functionele enzymatisch bepalingen. Indien de herkomst, aard en functie van het gekloneerde gen afdoende is bewezen is er sprake van een gekarakteriseerde sequentie en kan er ingeschaald worden volgens f t/m i.
• Wanneer uit een pool van random sequenties een specifiek gen gekloneerd gaat worden, waarvan de sequentie en functie bekend zijn, kan met specifieke nested primers een specifiek PCR fragment gegenereerd worden. Nadat de identiteit van dat fragment met een gevalideerde methode bevestigd is, bijvoorbeeld door sequentie analyse of restrictie enzym analyse in combinatie met de grootte van het fragment, mag er van een gekarakteriseerde sequentie uitgegaan worden.
• Indien een bekende sequentie van derden is verkregen, dan kan de identiteit van de sequentie (de reinheid) vastgesteld worden met behulp van restrictie-enzym analyse aangezien het hier een secondaire karakterisering betreft.

Voorbeelden:

1. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis (klasse 3) waarbij complete genen zijn geamplificeerd middels RT-PCR. Inschaling ML-II via 5.2.a.
2. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis waarbij korte sequenties van ten hoogste 50 bp (doel: amplificatie van korte antigene en merker sequenties) worden gekloneerd. Inschaling ML-II via 5.2.d aangezien door de beperkte grootte van de fragmenten er geen schadelijke genproducten gekloneerd zullen worden. Via een 2.8 verzoek kan om lagere inschaling worden gevraagd. Hierbij dient een onderbouwing geleverd te worden waarbij bijvoorbeeld de gevolgde wijze van klonering en eventueel gevolgde karakterisatie stappen betrokken worden. 
3. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij antibioticumresistentie tegen klinisch relevante middelen uit E. coli in Salmonella typhimurium (klasse 2), waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-III via 5.3.f.
4. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij vetzuurmetabolisme (zonder schadelijke eigenschappen) uit Mycobacterium tuberculosis, in Salmonella typhimurium (klasse 2) waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-II via 5.3.i.

Hoe moet nu bij de risicobeoordeling omgegaan worden met gekarakteriseerde dan wel ongekarakteriseerde sequenties in combinatie met een potentieel schadelijk genproduct?

In de inschalingsartikelen van bijlage 5, onder 5.2 t/m 5.4.3 is er voor de inschaling van alle activiteiten een onderverdeling gemaakt in gekarakteriseerde sequenties (f t/m i) en ongekarakteriseerde sequenties (a t/m e).

Gekarakteriseerde sequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen f t/m i is er sprake van activiteiten met gekarakteriseerde sequenties en zijn de eigenschappen van de sequentie bepalend voor de inschaling. Als het virale sequenties betreft wordt ingeschaald onder g of h (NB. enkelvoudige virale sequenties kunnen indien voldoende gekarakteriseerd onder 5.2, 5.3 en 5.4.1 ook onder i. worden ingeschaald). Zijn het niet-virale, potentieel schadelijke sequenties afkomstig van micro-organismen of hogere organismen dan moet ingeschaald worden volgens f. Als de sequenties voldoen aan de criteria van bijlage 2, lijst A3 en dus onschadelijk zijn, dan kan er ingeschaald worden via i.

Ongekarakteriseerde donorsequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen a t/m e is er sprake van activiteiten met ongekarakteriseerde sequenties die afkomstig zijn van een donor of van verschillende donoren waarbij de aard en de functie van de sequenties nog niet bepaald is. Daarmee zijn de eigenschappen van de donor bepalend voor de inschaling.

Het is bekend dat veel niet-virale pathogenen schadelijke sequenties bevatten. In dat geval dient er voor ongekarakteriseerde sequenties ingeschaald te worden volgens a, aangezien niet uitgesloten kan worden dat het mogelijk een schadelijk genproduct betreft. Indien door de werkwijze uitgesloten wordt dat schadelijke sequenties gekloneerd worden uit niet-virale pathogenen van klasse 2 of 3 die al dan niet schadelijke sequenties bevatten, dan kan ingeschaald worden volgens d.

Als deze sequenties afkomstig zijn van virale donoren dan dient ingeschaald te worden onder b (in geval van een voor eukaryote cellen infectieus virus) of c (in geval van een defect, voor eukaryote cellen infectieus virus). In het geval van virale sequenties is de classificatie van het virus waaruit de sequentie afkomstig is bepalend voor de inschaling van de sequentie. Indien het om een onbekend of niet geclassificeerd virus gaat, dient men altijd een artikel 2.8 verzoek te doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen. 

Als de donor een hoger organisme is en geen schadelijke genproducten bevat, dan kan via e ingeschaald worden. Echter, ook bij hogere organismen kan niet in alle gevallen uitgesloten worden dat er toch schadelijke genproducten aanwezig zijn en gekloneerd worden. Dit is met name het geval bij verrijking van (potentieel) schadelijke sequenties gedurende het kloneringsproces. In een dergelijk geval bestaat de mogelijkheid dat bij ongekarakteriseerde sequenties van hogere organismen toch via a moet worden ingeschaald.

Voorbeelden:

1. Wanneer een genomische of cDNA bank van land- en tuinbouwgewassen gekloneerd wordt in E. coli K12 dan kan via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald. Land- en tuinbouwgewassen worden beschouwd als veilig, hoewel het bekend is dat ze wel toxische stoffen kunnen bevatten, maar die zijn het resultaat van een hele reeks van genen die onderdeel zijn van een pathway. Alleen wanneer het doel van de experimenten is om de complete pathway te kloneren en tot expressie te brengen in een nieuwe gastheer moet er via 5.2.a op ML-II ingeschaald worden.
2. Ook genomische of cDNA banken van zoogdieren of de mens welke gekloneerd worden in E. coli K12 kunnen via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald, ondanks dat het DNA mogelijk transposons, sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die geassocieerd zijn met pathogene effecten (zoals bv. prionen) of virale sequenties bevat. Alleen als men dit soort genen actief opzoekt dan wel gaat verrijken, dient er te worden ingeschaald via 5.2.a op ML-II uitgaande van de (potentiële) schadelijkheid van deze genproducten of via 5.2.b. of 5.2.c. in geval van virale sequenties.
3. Wanneer een genomische of cDNA bank van micro-organismen die voorkomen in grondmonsters gekloneerd wordt in E. coli K12 dan moet er vanuit gegaan worden dat een mengsel van al het genetisch materiaal van de potentieel aanwezige micro-organismen in de grond gekloneerd wordt. In de grond komen namelijk ook pathogene micro-organismen voor die schadelijke sequenties bevatten. Daarom moet er bij de risicobeoordeling van uitgegaan worden dat iedere sequentie van alle aanwezige micro-organismen gekloneerd kan zijn en dus wordt bij de risicobeoordeling ingeschaald volgens inschalingsartikel 5.2.a ‘de donor bevat een schadelijk genproduct dat werkzaam kan zijn in de gastheer’.

Bovenstaande voorbeelden zijn van toepassing op artikel 5.2. Voor de inschaling van ongekarakteriseerde sequenties via 5.3 en 5.4 kunnen veelal soortgelijke redeneringen toegepast worden. Er dient bij de inschaling echter altijd rekening gehouden te worden met de context van het ggo waarin het genproduct gekloneerd wordt. Ter illustratie: een genproduct coderend voor een immuunmodulerend eiwit dat onschadelijk is bij klonering in een apathogene E. coli K12 stam zou in de context van een ander ggo, bijvoorbeeld een pathogeen virus of een pathogene bacterie, wel degelijk schadelijk kunnen zijn. In dat geval wordt dus hetzelfde genproduct als onschadelijk beschouwd bij inschaling via 5.2 en als schadelijk beschouwd bij inschaling via 5.3 of 5.4.

6. Inschalingsartikel 5.2

Inschalingsartikel 5.2: De samenstellende delen behoren niet tot de groep van inserties zoals bedoeld in bijlage 2 lijst A3. Indien dit wel het geval is dienen die delen beschouwd te worden als donorsequenties

Alle onderdelen van de vector moeten in de risicobeoordeling meegenomen worden om uit te sluiten dat er potentieel schadelijke genproducten of virale sequenties (waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren) in de vector aanwezig zijn. Indien één van de samenstellende delen van deze vector behoort tot de groep van inserties zoals beschreven in bijlage 2 lijst A3, dan mag dit samenstellende deel niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moet deze beoordeeld worden als donorsequentie.

Voorbeeld: een sequentie coderend voor een enzymatische functie betrokken bij transpositie moet beschouwd worden als donorsequentie, en zal, afhankelijk van de context van het ggo, mogelijk gezien worden als schadelijk genproduct.

Inschalingsartikel 5.2: De vector bevat geen virale sequenties, afkomstig van virussen die hogere eukaryoten als gastheer hebben, waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren. Indien dit wel het geval is, dienen die sequenties beschouwd te worden als donorsequenties

Indien in de vector virale sequenties aanwezig zijn die kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte, voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels, dan mogen deze virale sequenties niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moeten deze beoordeeld worden als donorsequenties. Afhankelijk van de karakterisatie en het al dan niet defect zijn van de virale vector volgt een inschaling volgens 5.2, onder b, c, g of h.

Het aanwezig zijn van virale sequenties die coderen voor een enkel viraal genproduct* of regulatoire sequentie, bijvoorbeeld de aanwezigheid van een CMV promoter, SV40 polyA sequentie, IRES sequentie of het gen coderend voor het VSV-G eiwit, in de vector backbone is toegestaan, omdat dergelijke sequenties op zich niet kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels. Zodoende mogen deze sequenties wel beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone. Wel moeten deze virale sequenties meegenomen worden in de risicobeoordeling indien de vector wordt toegevoegd via bijvoorbeeld transfectie of transductie aan animale cellen die virale sequenties bevatten. In dat geval vindt inschaling plaats via 5.4.2 of 5.4.3.

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als donorsequentie beoordeeld te worden.

8. Lijst van donororganismen

Lijst van donororganismen die geen schadelijke genproducten bevatten

De volgende donor organismen kunnen bij de inschaling volgens bijlage 5, artikel 5.2: activiteiten met a-pathogene gastheren, worden beschouwd als donor organismen die geen schadelijk genproduct bevatten, ondanks dat het DNA mogelijk transposons, sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die geassocieerd zijn met pathogene effecten (zoals bv. prionen) of virale sequenties bevat. Zolang het niet de bedoeling is om dergelijke producten tot expressie te laten komen of te verrijken kan er bij de inschaling vanuit gegaan worden dat er geen schadelijke genproducten aanwezig zijn.

• zoogdier (waaronder de mens)
• land- en tuinbouwgewassen
• organismen van bijlage 2 lijst A1

Echter als men actief naar dit soort genen op zoek gaat, dan wel ze actief gaat verrijken, dient er bij de inschaling van uitgegaan te worden dat van deze genproducten in de context van het ggo een schadelijk effect kunnen hebben. Dit geldt evenzeer als men deze genproducten in pathogene micro-organismen (bijlage 5, artikel 5.3) of virussystemen (bijlage 5, artikel 5.4) wil gaan toepassen.

10. Transfectie onder 5.4.1

De transfectie van cellen met virale vectoren onder 5.4.1

Artikel 5.4.1 is bedoeld om handelingen met animale cellen en plantencellen in associatie met een plasmide vector of een virale transfervector, die ook als expressievector gebruikt kan worden, in te schalen; e.g. transfectie van animale cellen en plantencellen. Artikel 5.4.1 dient NIET gebruikt te worden indien de productie van virale partikels en virale replicons beoogd wordt. Afhankelijk van de biologische inperking dient de productie van virale partikels en virale replicons ingeschaald te worden volgens artikel 5.4.2 of 5.4.3.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met behulp van een virale transfervector:
Het doel is de expressie van het transgen (eiwit en/of RNA) en NIET de productie van virale partikels of virale replicons. De helper/packaging plasmiden, benodigd voor de productie van virale partikels, worden dan ook niet samen met de virale transfervector getransfecteerd. Wel dient er rekening gehouden te worden met virale sequenties aanwezig in de gastheer en de vector waardoor er mogelijk genetisch gemodificeerd virus kan ontstaan.

Transfectie van cellen met lentivirale transfervector:
Indien de cellen vrij zijn van HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere niet-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.h op ML-I.
Indien de cellen potentieel geïnfecteerd zijn met HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere non-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.g op ML-III (PG3, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent lentivirus kan niet uitgesloten worden).

Transfectie van cellen met muizenretrovirale transfervector:
Inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, een substantieel deel van de cellijnen die voor wetenschappelijk onderzoek worden gebruikt bevatten retrovirussequenties (CGM/131002-01, CGM/131220-01 en CGM/140228-01), hierdoor kan het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent retrovirus niet worden uitgesloten).
Transfectie van retrovirale transfervectoren gebaseerd op de muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen dl587 rev, Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Murine embryonic stem cell virus (MESV), Murine leukemia virus (MLV), Murine stem cell virus (MSCV), Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en Spleen focus forming virus (SFFV) mag via 5.4.1.g op ML-II worden ingeschaald.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met een plasmide dat virale sequenties bevat die coderen voor een enkel viraal genproduct of regulatoire sequentie*:
De cellen in dit voorbeeld zijn vrij van virale sequenties, waardoor er géén al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd kan worden.

Transfectie van cellen met een plasmide dat het GFP gen tot expressie brengt onder controle van een CMV promoter:
Inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd worden en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke sequentie aanwezig).

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als defect, voor eukaryote cellen infectieus virus via 5.4.3 ingeschaald te worden.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie. De productie van virale partikels en virale replicons wordt niet beoogd, maar het ontstaan van genetisch gemodificeerd virus kan niet worden uitgesloten als gevolg van de in de cellen aanwezige virale sequenties.

De cellijn COS-7 bevat een onvoldoende gekarakteriseerde hoeveelheid SV40 sequenties en de vorming van genetisch gemodificeerd SV40 kan niet worden uitgesloten wanneer transfecties met plasmiden met een SV40 origin of replication worden toegepast.

· Transfectie van COS-7 cellen:

• plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent SV40 kan niet uitgesloten worden).
• plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van COS-1 cellen:

• plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (PG2, het ontstaan van defect genetisch gemodificeerd SV40 kan niet uitgesloten worden).
• plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van HEK293 cellen:

• plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).
• plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van (potentieel) EBV positieve cellen:

• plasmide met EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent EBV kan niet uitgesloten worden).
• plasmide zonder EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd EBV geproduceerd worden).

NB: Indien in de vector een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct dan kan een hogere inschaling van toepassing zijn (inschaling volgens 5.4.1.f).

12. Inschalingsartikel 5.4.4

Activiteiten met al dan niet genetisch gemodificeerde animale cellen dan wel plantencellen al dan niet in associatie met een genetisch gemodificeerd micro-organismen (5.4.4)

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.b en 5.4.4.c?

Onder onderdeel b betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een dier afkomstige cellen. Het dier is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een dier (veelal afkomstig van ongemodificeerde dieren of genetische gemodificeerde ‘transgene’ dieren die op D-I inperkingsniveau worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

NB: Voor toepassing van het inschalingsartikel 5.4.4.b mogen animale cellen ruimer geïnterpreteerd worden dan enkel en alleen primaire cellen en cellijnen. Ook (delen van) organismen die onder microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd worden, kunnen met behulp van dit artikel ingeschaald worden (zie ook toelichting onder 10).

Onder onderdeel c betreft het cellen afkomstig van dieren die in vivo aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is of het DM-niveau waarop de dieren zijn ingeschaald (zie bijlage 5.6) leidend voor de inschaling van de uit deze dieren afkomstige cellen op ML niveau, of voor cellen afkomstig van dieren in associatie met genetisch gemodificeerde micro-organismen waarbij een eventuele biologische inperking van het micro-organisme niet door het dier is gecomplementeerd, het ML niveau corresponderend met het inperkingsniveau waarop de micro-organismen moeten worden gehanteerd.

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.e en 5.4.4.f?

Onder onderdeel e betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een plant afkomstige cellen. De plant is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een plant (veelal afkomstig van wildtype planten of planten die op PL-I, PC-I, PKa-I of PKb-I worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden, zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

Onder onderdeel f betreft het cellen afkomstig van planten die aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is het inperkingsniveau waarop de planten zijn ingeschaald (zie bijlage 5.5.3) leidend voor de inschaling van de uit deze planten afkomstige cellen op ML niveau.

Hierbij dient er rekening te worden gehouden dat handelingen met planten in associatie met micro-organismen die op ML-II niveau moeten worden gehanteerd in geval van aërogene verspreiding van het micro-organisme (bv. het geval bij toepassing van sporulerende schimmels), conform 5.5.3.c op PCM-III/PKM-III kunnen zijn ingeschaald. Voor cellen afkomstig uit deze planten geldt dus op grond van 5.4.4.f een ML-III inschaling.

De gebruiker kan een artikel 2.8 verzoek doen om met deze op ML-III niveau ingeschaalde cellen te mogen werken op ML-II niveau. Bij dit verzoek dient bijvoorbeeld te worden onderbouwd hoe kruiscontaminatie met klasse 3 genetische gemodificeerde organismen op PCM-III/PKM-III inperkingsniveau is voorkomen.

14. Vervaardiging van dieren en dieren in associatie met gg-micro-organismen

Handelingen met animale cellen (ES-cellen/bevruchte oöcyten) die tot dieren leiden

Handelingen met animale cellen op ML-I niveau waarbij homologe recombinatie in ES-cellen wordt toegepast of micro-injectie van DNA in bevruchte oöcyten, leiden in de meeste gevallen tot dieren die op D-I moeten worden gehuisvest (bijlage 5.6). Dieren die vervaardigd zijn met plasmiden waarin virale sequenties of transposons aanwezig zijn, worden mogelijk hoger ingeschaald. Alleen voor de diersoorten genoemd in artikel 5.6.1.a is de manier van huisvesten van de dieren vastgesteld. Voor alle andere genetisch gemodificeerde dieren moet de manier van huisvesten via een artikel 2.8 verzoek voorgelegd worden aan Bureau GGO genetisch gemodificeerd organisme (genetisch gemodificeerd organisme ).

Inschaling van lentiviraal vervaardigde DM-I dieren op D-I  

Activiteiten met dieren (wildtype dieren of gg-dieren conform 5.6.1.a) in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels of lentiviraal getransduceerde cellen die conform de criteria van bijlage 5 afkomstig zijn van ML-I inperkingsniveau worden ingeschaald via 5.6.3.b op DM-I inperkingsniveau. 
Genetisch gemodificeerde dieren die vervaardigd zijn met een genetisch gemodificeerd lentivirus dat conform de criteria van bijlage 5 afkomstig is van ML-I inperkingsniveau worden ingeschaald via 5.6.2.a. op DM-I inperkingsniveau. 
Inschaling op D-I kan middels een 2.8 verzoek worden voorgelegd waarbij u in uw 2.8 verzoek de voorwaarden die noodzakelijk zijn voor inschaling op D-I dient te benoemen. Deze voorwaarden zijn noodzakelijk om afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes in het dier te bereiken zodat er geen uitscheiding van lentivirale deeltjes uit het dier kan plaatsvinden en het afvoeren van afval op D-I inperkingsniveau is toegestaan. Hieronder een opsomming van de voorwaarden die op grond van COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) adviezen worden gehanteerd:

• Voor dieren in associatie met lentiviraal getransduceerde cellen waarin reeds afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes in de cellen is bereikt dient u de volgende voorwaarden op te nemen in uw 2.8 verzoek:
  • In de cellen is een reductie van het aantal vrije vectordeeltjes gerealiseerd, die minimaal 100 maal hoger is dan de titer van het inoculum. Deze reductiefactor is berekend aan de hand van de titer van het virale inoculum, de kweektijd na transductie, de halfwaardetijd van het virus op basis van het toegepaste envelopeiwit en het aantal wasstappen en inactiverende stappen of er is een wachttijd van 7 dagen na transductie van de cellen gehanteerd.

Bij het toepassen van de formule voor berekening van de reductieratio voor werkzaamheden met lentiviraal getransduceerde animale cellen dient u rekening te houden met de parameters zoals vermeld in het COGEM rapport ‘COGEM report 2020‐01’ en COGEM advies CGM/200507-01. Indien het niet mogelijk is om de reductieratio te berekenen kan een veiligheidsperiode van 7 dagen gehanteerd worden (CGM/210218-01).

• Voor dieren in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels (of lentiviraal getransduceerde cellen waarin in de kweek nog niet voldoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes is bereikt) dient u de volgende voorwaarden (conform COGEM advies CGM/090331-03) op te nemen in uw 2.8 verzoek:
  • Er is in het dier een reductie van het aantal vrije vectordeeltjes gerealiseerd, die minimaal 100 maal hoger is dan de titer van het inoculum. Deze reductiefactor is berekend aan de hand van de titer van het virale inoculum, de tijd na transductie en de halfwaardetijd van het virus op basis van het toegepaste envelopeiwit; en
  • de dieren zijn na inoculatie met de lentivirale partikels/lentiviraal getransduceerde animale cellen minimaal 14 dagen op DM-I gehuisvest.  

 NB: In in vitro getransduceerde macrofagen en macrofaagachtige cellen kunnen (ook na wasstappen, na 7 dagen kweek, of 14 dagen wachttijd) lentivirale vectordeeltjes intact aanwezig blijven in de cellen of gebonden als antilichaam-virus-complexen op de plasmamembraan. Kadaverafval van D-I dieren in associatie met in vitro  getransduceerde macrofaagachtige cellen dient daarom als DM-I afval te worden afgevoerd, ook indien een afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes is gerealiseerd. Bij invasieve handelingen kunnen daarbij maatregelen vanuit ARBO Arbeidsomstandigheden (Arbeidsomstandigheden)-overwegingen noodzakelijk zijn (CGM/220517-02).

• Voor dieren die zijn ingeschaald conform 5.6.2.a. op DM-I dient u als voorwaarde op te nemen dat het de nakomelingen (F1 en verder) van de DM-I dieren betreft zoals vermeld in het COGEM advies CGM/090331-03. In geval van F0 dieren dient er een afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes te zijn gerealiseerd zoals hierboven aangegeven voor dieren in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels.  

U kunt voor uw 2.8 verzoek een brede verwijzing hanteren zodat u niet bij ieder nieuw ggo-dier een 2.8 verzoek hoeft voor te leggen. Een brede verwijzing houdt in dat u verwijst naar ‘de genetisch gemodificeerde dieren die conform 5.6.1.a op D-I zijn ingeschaald in associatie met de lentiviraal getransduceerde cellen of lentivirale partikels die conform 5.4.2.h en 5.4.2.i op ML-I zijn ingeschaald’. 

16. Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien worden voorgeschreven voor de huisvesting van kleine proefdieren (zoals muizen, ratten en cavia’s) in associatie met genetisch gemodificeerde micro-organismen. Kleine proefdieren en sommige grotere proefdieren (zoals fretten) kunnen ook worden gehuisvest in isolatoren. In de praktijk gaat het hier meestal om ggo’s die voor laboratoriumwerkzaamheden zijn ingeschaald op ten hoogste ML-II niveau, die zich aërogeen kunnen verspreiden (zoals adenovirus) of die serieuze ziekteverschijnselen kunnen veroorzaken, waardoor additionele inperking nodig is om verspreiding naar mens en milieu te beperken of te voorkomen. Het concept dat hierbij gehanteerd wordt, is dat elke kooi of isolator een microbiologische eenheid voorstelt die onafhankelijk is van alle andere kooien of isolatoren in de ruimte. Dit betekent feitelijk dat de microbiële inperking plaats vindt op het niveau van de kooi of de isolator en niet op het niveau van de ruimte. De inschaling van de dierexperimenten waarbij ggo’s van klasse 2 worden toegepast zal doorgaans op DM-II plaatsvinden waarbij een filtertopkooi of een isolator wordt voorgeschreven. Voor grotere proefdieren zal het gebruik van filtertopkooien of isolatoren geen optie meer zijn omdat de dieren er niet passend en veilig in gehuisvest kunnen worden. De inschaling van exprimenten met aërogeen verspreidende ggo’s in dergelijke grote proefdieren zal DM-III zijn; hierbij vindt de inperking ten aanzien van het milieu dus plaats op het niveau van de ruimte (e.g. onderdruk en HEPA filter) en worden ten aanzien van de medewerkerbescherming persoonlijke beschermingsmiddelen voorgeschreven.