1. Virale sequenties: 5.2, 5.3, 5.4.1

Virale sequenties bij inschalingsartikel 5.2, 5.3 en 5.4.1: infectieus virus, defect virus en enkele virale sequenties

In een defect virus zijn één of meerdere genen of regulatoire sequenties niet langer functioneel, of gedeleteerd, waardoor het virus een factor mist die nodig is voor het doorlopen van de complete virale levenscyclus. Het virus kan wel repliceren in animale cellen die voorzien in die factor, de ‘helperfunctie’. Virale sequenties kunnen, afhankelijk van de “compleetheid” van het virale genoom, ingeschaald worden als donorsequentie onder b/g, c/h of e/i:

b/g: er zijn virale sequenties aanwezig die kunnen leiden tot de vorming van een voor eukaryote cellen infectieus virus dan wel de vorming van virale replicons

Voorbeelden:

  • volledig genoom van een virus;
  • genoom van een deletiemutant waarin een niet essentieel gen gedeleteerd is;
  • sequentie coderend voor replicon systeem gebaseerd op een enkel genoomsegment.

c/h: hieronder dienen vectoren die virale sequenties bevatten die kunnen leiden tot de vorming van een defect, voor eukaryote cellen infectieus virus ingeschaald te worden. Ook vectoren die virale replicatiesignalen en packagingsignalen bevatten, zoals volledige genoomsegmenten en virale transfervectoren, dienen hieronder ingeschaald te worden.

Voorbeelden:

  • enkel genoomsegment van gesegmenteerd virus;
  • genoom van een deletiemutant waarin een essentieel gen gedeleteerd is;
  • genoom van een niet-gesegmenteerd virus gedeleteerd voor de 5’ en 3’ NTRs;
  • open reading frame (ORF) van een virus dat slechts 1 ORF bevat;
  • sequentie coderend voor enkel genoomsegment van een replicon systeem gebaseerd op meerdere genoomsegmenten;
  • lentivirale transfervector;
  • transfecties met meerdere plasmiden met op ieder plasmide één enkel gen of meerdere virale genen.

e/i: de aanwezige virale sequenties coderen voor uitsluitend één viraal genproduct of betreft een regulatoire sequentie en deze sequenties vallen niet onder de definitie van schadelijk genproduct.

LET OP: indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één ORF bevat, dan dient dit ORF als defect, voor eukaryote cellen infectieus virus ingeschaald te worden onder c of h.

Voorbeelden:

  • CMV promoter
  • SV40 promoter (SV40 ori is hierin aanwezig)
  • gen coderend voor VSV-G eiwit

NB: Indien in de virale vector een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct kan een hogere inschaling van toepassing zijn.

2. Virus van klasse 4, 3 of 2 

Inschalingslid b, c, g en h: virus van klasse 4, 3 of 2

Om inschalingslid b, c, g of h van toepassing te laten zijn, moet het virus benoemd zijn op de lijst 4.1 van Bijlage 4 van de Regeling. Deze lijst bevat de classificatie van virussen op basis van hun ziekteverwekkend vermogen voor mens en/of dier.

Indien het virus niet op deze lijst voorkomt dan moet een risicobeoordeling overeenkomstig bijlage 8 van de Regeling uitgevoerd worden en een artikel 2.8. verzoek worden gedaan om de pathogeniteitsklasse van het virus vast te stellen. Bij deze risicobeoordeling dient aangegeven te worden, met gebruikmaking van de definities van de klassen van micro-organismen, tot welke klasse het betreffende virus behoort.

3. Endogeen virus onder 5.4.2

Een endogeen virus dat mogelijk aanwezig kan zijn in de gastheercel of- cellijn onder 5.4.2

Bij handelingen met animale en humane cellen en cellijnen in associatie met biologisch ingeperkte virale vectoren dient, naast met de vector en de donorsequentie, rekening te worden gehouden met (mogelijke) aanwezigheid van (wildtype) virussen en virale sequenties die bij de vervaardiging van de cellijn zijn toegepast of die als besmetting in de cellen aanwezig kunnen zijn. Er dient in de risicoanalyse rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van recombinatie en/of complementatie, waardoor er een recombinant (niet-biologische ingeperkt) virus kan ontstaan, hetgeen leidt tot een hogere inschaling, (artikel 5.4.3 in plaats van artikel 5.4.2 moet in een dergelijk geval worden toegepast, vanwege de opheffing van de biologische inperking van het virus).

Om aanwezigheid van wildtype virussen uit te sluiten kunnen cellen voorafgaand aan de werkzaamheden op de aanwezigheid hiervan worden gecontroleerd.Lees meer over endogeen virus onder 5.4.1

4. Productie virale partikels

Hoe dient de productie van virale partikels te worden ingeschaald?

Voor het produceren van virale partikels wordt over het algemeen gebruik gemaakt van twee methoden:

  • Cellen worden geïnfecteerd met een virus waardoor virus vermeerdering plaatsvindt.
  • Cellen worden getransfecteerd met een of meerdere plasmiden waardoor virus productie plaatsvindt.

Afhankelijk van de biologische inperking dient de productie van virale partikels en replicons ingeschaald te worden volgens artikel 5.4.2 of 5.4.3. Inschaling volgens 5.4.2 is slechts toegestaan voor een beperkte groep van biologisch ingeperkte virale systemen. Alle overige virale systemen dienen ingeschaald te worden volgens 5.4.3. De pathogeniteitsklasse van het betreffende virus kan bepaald worden aan de hand van bijlage 4, lijst 4.1 van de Regeling.

NB: Artikel 5.4.1 dient niet gebruikt te worden voor de productie van virale partikels en replicons!

Voorbeeld: 

  • Infectie van cellen met full-length virus van pathogeniteitsklasse 3 (PG3), bijvoorbeeld het rabies virus, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is geclassificeerd als PG3 (lijst 4.1), het systeem is niet biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Voorbeeld:

  • Transfectie van cellen met één of meerdere plasmiden ten behoeve van productie van full-length virus van PG3, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is geclassificeerd als PG3, het systeem is niet biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Transfectie van cellen met één of meerdere plasmiden ten behoeve van productie van virus replicons gebaseerd op een PG3 virus, waarbij het GFP gen aanwezig is in het virale genoom: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: De virale vector is gebaseerd op een virus van PG3, het systeem wordt niet gezien als biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig. Via een 2.8 verzoek kan beargumenteerd worden aangegeven waarom dit replicon systeem (de combinatie van gastheercel, virale vector en donorsequentie) als biologisch ingeperkt beschouwd kan worden en op een lager inperkingsniveau ingeschaald kan worden.

Voorbeeld:

  • Transfectie van cellen met plasmiden ten behoeve van productie van genetisch gemodificeerde 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels of translentivirale partikels, waarbij het GFP gen aanwezig is in de transfervector: inschaling via 5.4.2.i op ML-I. Toelichting: De virale vector is gebaseerd op een virus van PG3, het systeem is biologisch ingeperkt (staat in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

5. Biologisch ingeperkt systeem

Inschaling onder bijlage 5, onder 5.4.2 (biologisch ingeperkte systemen)

Biologische inperking houdt in dat het vermogen van een (micro-)organisme om te overleven en te verspreiden in de natuur beperkt is. Het organisme kan deze beperking van nature bezitten, of de beperking kan door middel van mutatie of genetische modificatie zijn bewerkstelligd. Een biologische inperking kan ertoe leiden dat een organisme in zijn oorspronkelijke niche niet kan overleven of niet kan competeren met andere organismen. In andere gevallen kan het organisme vanwege de biologische inperking slechts overleven in een zeer speciale niche die in het ontvangende milieu niet aanwezig is. Case-by-case wordt vastgesteld of een organisme of systeem een relevante biologische inperking bezit, zodat met deze inperking rekening kan worden gehouden in de inschalingsartikelen van bijlage 5.

Inschaling volgens artikel 5.4.2 is slechts toegestaan voor een beperkte groep van biologisch ingeperkte virale systemen. Het betreft de volgende systemen.

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 2 en 3, die beschouwd worden als klasse 1:

  1. baculovirus met p10-deletie of met polyhedrine-deletie;
  2. modified vacciniavirus Ankara (MVA) en vacciniavirus NYVAC;
  3. kanariepokkenvirus ALVAC en kippenpokkenvirus TROVAC;
  4. van Semliki-forest virus (SFV) afgeleide replicons waarbij het genetisch gemodificeerde replicon is geproduceerd met behulp van een meervoudig plasmiden systeem;
  5. adeno-associated dependoparvovirus A en B;
  6. replicatie-deficiënte virale vectoren afgeleid van adeno-associated dependoparvovirus A of B met capsiden van dependoparvovirussen;
  7. lentivirus dat wordt vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem of een translentiviraal vectorsysteem.

NB: uitsluitend het uit drie vectoren bestaande SFV replicon systeem bestaande uit de vector pSFV3 (bevat de niet-structurele genen van SFV) en de twee helper plasmiden, pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2, is tot nu toe als biologisch ingeperkt beoordeeld. De helper plasmiden pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2 bevatten respectievelijk de genen coderend voor het capside eiwit en de envelop eiwitten van SFV. In het capside gen is de autoprotease activiteit verwijderd door mutatie van drie nucleotiden resulterend in een serine-alanine mutatie. Overige SFV replicon systemen dienen via 5.4.3 te worden ingeschaald.

Voorbeeld:

  • Handelingen met MVA, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.i op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Handelingen met MVA, waarbij een enkel viraal gen coderend voor een (antigeen) HPV eiwit gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.h op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en de in de gastheer gebrachte virale sequentie (afkomstig van een PG2 virus) kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes).

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 2, die ingeschaald kunnen worden via 5.4.2:

  1. Influenza stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 die zijn vervaardigd middels recombinant DNA technieken;
  2. afgeleiden van deze stammen waarbij minimaal 6 genoomsegmenten afkomstig zijn van deze stammen en twee heterologe gensegmenten van andere Influenza A stammen. Daarbij geldt voor heterologe HA-coderende gensegmenten dat de aanwezigheid van een basische klievingsplaats is uitgesloten.

NB. Inschalingsartikel 5.4.2 mag niet worden toegepast als door de combinatie van gastheercel, virale vector en/of donorsequentie de inperking van het systeem wordt opgeheven (gecomplementeerd).

6. Biologisch ingeperkt systeem (lentivirale systemen)

Toelichting inschaling 2de en 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem of een translentiviraal vectorsysteem onder 5.4.2 en inschaling andere lentivirale systemen onder 5.4.3.

Voor de productie van de lentivirale vectoren worden de verschillende virusfuncties opgesplitst en over tenminste drie vectoren verdeeld (zie Tabel 1). Door deze opsplitsing moet de productie van replicatiecompetent lentivirus (RCL) voorkomen worden. De drie of meer vectoren zijn:

  1. de ‘transfervector’. Dit construct bevat het gewenste transgen, geflankeerd door virale LTRs. Het bevat ook het packaging signaal, zodat het transgen in de virusdeeltjes wordt ingepakt. In verschillende systemen (zie Tabel 1) is sprake van een transfervector waarbij uit de 3’LTR sequentie de promoter en enhancer sequenties zijn verwijderd resulterend in een ‘selfinactivating’ (SIN) vector.
  2. de ‘pseudotyping vector’. Dit is een expressievector voor een envelop eiwit. Meestal wordt het VSV-G gebruikt, waardoor de resulterende lentivirale vector een veel breder spectrum van doelwitcellen kan infecteren, dan HIV-1. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreken in deze constructen. Andere pseudotyperingsenvelopeiwitten, bijvoorbeeld glycoprotein van mazelen of hemagglutinin van influenza zijn ook toegestaan, maar pseudotyperingsenvelopeiwitten afkomstig van lentivirussen zijn uitgezonderd van inschaling onder 5.4.2.
  3. het ‘packagingconstruct’. Dit plasmide (of set van plasmiden) bevat de HIV-1 eiwitten, die nodig zijn voor virusproductie. Gag en Pol zijn de minimale componenten, maar daarnaast kunnen ook regulatoire en/of accessoire eiwitten aanwezig zijn. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreekt in dit construct.

De meest toegepaste lentivirale systemen staan in onderstaande tabel vermeld met hun specifieke eigenschappen.

 

2e generatie SIN

3e generatie SIN

Translenti

SIN (deletie 3’LTR)

Ja

Ja

nvt†

Aantal plasmiden

3

4

6

Aantal packaging plasmiden

1 of 3*

2

4

Accesoire genen aanwezig

Vif, vpr, vpu, nef

_

_

vpr

Aantal plasmiden met: 

Tat

Rev

1

+

+

1

-

+

1

+

+

Aantal recombinaties nodig voor RCL

3

4

4

Standaard inschaling volgens

5.4.2

5.4.2

5.4.2

Inperking

ML-I

ML-I

 

ML-I

*in sommige 2de generatie systemen is er sprake van 3 (gag/pol, rev en tat plasmide) in plaats van 1 packaging plasmide. Dergelijke 2de generatie systemen worden ook als biologisch ingeperkt beschouwd en mogen via 5.4.2. worden ingeschaald.

† translentiviraal systemen kunnen afhankelijk van het systeem, zowel SIN als niet SIN transfervectoren bevatten. Beide translenti systemen kunnen rechtstreeks op ML-I ingeschaald worden. 

In de Regeling worden uitsluitend lentivirale partikels die worden vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem of een translentiviraal vectorsysteem als biologisch ingeperkt beschouwd. Deze systemen moeten voldoen aan de definities zoals vermeld in artikel 2 van de Regeling. Uitsluitend lentivirale vectorsystemen die voldoen aan de verdere specificaties zoals vermeld in tabel 1 worden in de Regeling als biologisch ingeperkt beschouwd en worden ingeschaald onder 5.4.2.

Lentivirale systemen die niet voldoen aan de bovenvermelde definities worden onder artikel 5.4.3 ingeschaald.

Voorbeeld:

Inschaling 2de of 3de generatie SIN lentiviraal systeem:

Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een humane promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.i op ML-I. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een CMV promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.h op ML-I. Toelichting: het systeem gebaseerd op PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG2 virus (CMV)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Inschaling combinaties van lentivirale systemen:

Productie van lentivirale partikels, waarbij een  niet-SIN translentivirale  transfer vector, waarin het GFP gen is gekloneerd, wordt gecombineerd met 2de en 3de generatie lentivirale packaging vectoren: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Voor productie van lentivirale partikels waarbij een niet-SIN translentivirale vector wordt gecombineerd met 3de generatie packaging vectoren kan via een 2.8 procedure om omlaagschaling worden verzocht (op grond van COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) advies CGM/200713-01). Voor productie van lentivirale partikels waarbij een niet-SIN translentivirale vector wordt gecombineerd met 2de generatie packaging vectoren is niet voldoende biologisch ingeperkt om voor  omlaagschaling in aanmerking te komen (zie CGM/200713-01).

Omgang met een aantal veelgebruikte virale sequenties:

  • Immortalisatie van cellijnen door middel van de immortaliserende virale eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T of Ad5 E1A die tot expressie worden gebracht met behulp van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels of translentivirale partikels kan via artikel 5.4.2.h op ML-I worden ingeschaald.
  • Toepassing van bepaalde veelgebruikte korte virale sequenties afkomstig van ongeclassificeerde virussen of van klasse 3 en klasse 4 virussen (uitsluitend 2A sequenties, VSV-tag, HA-tag en AU-1 tag) als donorsequentie in 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels of translentivirale partikels mag via 5.4.2.h op ML-I worden ingeschaald.
  • Productie van tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentivirale partikels of translentivirale partikels, waarbij sprake is van regulatoire sequenties afkomstig van muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen (Murine leukemia virus (MLV), murine embryonic stem cell virus (MESV), Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), murine stem cell virus (MSCV), spleen focus forming virus (SFFV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en dl587 rev) in de transfervector: mag via 5.4.2.h op ML-I worden ingeschaald.

Omgang met schadelijke genproducten in biologisch ingeperkte lentivirale vectoren:

Sequenties coderend voor toxines, allergenen en prionen dienen in de context van een biologisch ingeperkt lentiviraal vectorsysteem via 5.4.2.f op ML-II inperkingsniveau te worden ingeschaald. 
Overige potentieel schadelijke genproducten zoals sequenties coderend voor oncogenen, pathogeniteitsfactoren, immuunmodulatoire genen en aggregerende eiwitten uitgezonderd prionen in een biologisch ingeperkt lentiviraal systeem kunnen, mits zij niet van invloed zijn op de biologische inperking, via 5.4.2.i op ML-I inperkingsniveau worden ingeschaald. De redenatie hierachter is dat de milieurisico’s van de nog aanwezige vrije lentivirale vectordeeltjes bij de werkzaamheden met dit type vectoren verwaarloosbaar klein zijn (zie COGEM advies CGM/210218-01), omdat de genetische informatie die essentieel is voor replicatie ontbreekt waardoor verder verspreiding niet mogelijk is.
NB: Vanuit ARBO Arbeidsomstandigheden (Arbeidsomstandigheden) overwegingen zijn veiligheidsmaatregelen noodzakelijk om blootstelling van de medewerkers aan vrije lentivirale vectordeeltjes te voorkomen. Handvatten voor deze maatregelen en formules/veiligheidsperiodes die gehanteerd kunnen worden voor de reductie van het aantal vrije lentivirale vectordeeltjes in het kweekmedium naar verwaarloosbare hoeveelheden, vindt u onder paragraaf 6.1 van het COGEM advies CGM/210218-01.

7. Inschaling van werkzaamheden met influenza A stammen

Toelichting inschaling influenza A stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 onder 5.4.2 en inschaling andere influenza A stammen onder 5.4.3.

In het licht van de voortschrijdende wetenschappelijke kennis en inzichten over het Influenza A virus heeft de COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) geoordeeld dat het merendeel van de influenza A virussen voldoen aan de criteria voor een klasse 2 indeling. Deze classificatie is per 1 januari 2023 aangepast in bijlage 4. 

Er zijn meerdere routes voor de inschaling van werkzaamheden met Influenza A:

  • Werkzaamheden met Influenza stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 en afgeleiden die vervaardigd zijn middels recombinant DNA technieken kunnen nog steeds conform artikel 5.4.2 worden ingeschaald. Onder voorwaarde dat minimaal 6 genoomsegmenten afkomstig zijn van deze stammen en twee heterologe gensegmenten van andere Influenza A stammen (voor heterologe HA-coderende gensegmenten is de aanwezigheid van een basische klievingsplaats uitgesloten).
  • Werkzaamheden met andere Influenza A stammen die volgens de Regeling ggo PG2 of PG3 zijn worden via artikel 5.4.3 ingeschaald. Let op, hierbij dient u wel te specificeren welke influenza A stammen u gaat toepassen. U kunt niet breed naar Influenza A van PG2 of PG3 verwijzen.

Voorbeelden:

  • Productie van A/PR/8/34, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het virus achter een endogene promoter: inschaling via 5.4.2.i op ML-II.
  • Productie van A/PR/8/34, met heterologe HA en NA genoomsegmenten van een andere influenza A virusstam, waarbij de aanwezigheid van een polybasische klievingsplaats is uitgesloten: inschaling via 5.4.2.h op ML-II.
  • Productie van Influenza A Port Chalmers/1/73 met de heterologe HA en NA genoomsegmenten van Influenza A Udorn/307/72, waarbij de aanwezigheid van een polybasische klievingsplaats is uitgesloten: inschaling via 5.4.3.h op ML-II met onderbouwing, waarbij u in dit geval kunt verwijzen naar CGM/220216-01. Voor meer informatie zie toelichting 21.
  • Productie van Influenza A Port Chalmers/1/73 met heterologe HA genoomsegmenten met polybasische klievingsplaats van een Influenza A stam: inschaling via 5.4.3.h op ML-III.
  • Productie van Influenza A H7N9, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het virus achter een endogene promoter: inschaling via 5.4.3.i op ML-III

8. Inschalingsartikel 5.4.3.b en 5.4.3.g

5.4.3.b en 5.4.3.g: virale vectoren die als donorsequentie een voor eukaryote cellen infectieus virus bevatten

Het gaat bij 5.4.3.b en 5.4.3.g om niet-biologisch ingeperkte virale vectoren van klasse 4, 3 of 2. Daarbij zijn in deze vectoren (als donorsequentie) sequenties van een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk klasse 4, 3 of 2 toegepast en deze donorsequenties kunnen zelf ook leiden tot de vorming van autonoom replicerende deeltjes. Er zijn dus twee soorten replicerende virusdeeltjes aanwezig.

Voorbeeld:
een vacciniavirus vector (PG2 humaan pathogeen) waarin een compleet genoom van een sindbisvirus (PG2 humaan pathogeen) is gekloneerd, waardoor naast nieuwe vacciniavirusdeeltjes (met het sindbisgenoom) ook autonoom replicerende sindbisvirusdeeltjes gevormd kunnen worden: inschaling 5.4.3.g op ML-II.
 

9. Chimere virussen

Wanneer is sprake van een chimeer virus?

Van een chimeer virus is sprake bij uitwisseling of toevoeging van functionele sequenties op genomisch niveau, zoals (delen van) genen of (delen van) regulatoire virale sequenties van één virusstam met de ‘backbone’ van een andere virusstam. Een voorbeeld van een chimeer virus is een humaan coronavirus van stam X waarbij uitwisseling van structurele of niet-structurele genen met een dierlijk coronavirus Y heeft plaatsgevonden dat moet worden ingeschaald op ML-II volgens 5.4.3.h.

10. Inschalingsartikel 5.4.3.c en 5.4.3.h

Bij 5.4.3.c en 5.4.3.h: virale vectoren die als donorsequentie een of meer virale sequenties bevatten die niet coderen voor een voor eukaryote cellen infectieus virus

Het gaat bij 5.4.3.c en 5.4.3.h om niet-biologisch ingeperkte virale vectoren van klasse 4, 3 of 2 waarbij in deze vectoren één of meerdere donorsequenties van een voor eukaryote cellen infectieus virus van respectievelijk klasse 4, 3 of 2 zijn toegepast. Daarbij geldt dat deze donorsequenties zelf niet kunnen leiden tot de vorming van autonoom replicerende deeltjes. Door de aanwezigheid van de donorsequentie is er echter sprake van een chimeer virus.

Voor virale vectoren van klasse 3 en 4 geldt, ongeacht de ingebrachte de donorsequentie, altijd een vergunningprocedure.

De te volgen procedure voor een virale vector van klasse 2 is afhankelijk van de klasse van de voor eukaryote cellen infectieus virus dat als donorsequentie gebruikt wordt.

Voor klonering van virale sequenties in de context van veelgebruikte vector systemen zoals adenovirale of retrovirale vectoren is in het inschalingsartikel de additionele zinsnede “dan wel afdoende is onderbouwd dat ML-II voldoende inperking biedt” opgenomen. Hierbij kan in de praktijk veelal worden volstaan met een beknopte onderbouwing waarbij kan worden verwezen naar de ML-II inschaling van reeds eerder beoordeelde werkzaamheden of met een verwijzing naar een algemeen COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) advies (bijvoorbeeld CGM/180316-01 en CGM/210218-01).

Voor andere chimere virussen waarbij de inperking van niveau II mogelijk niet voldoende bescherming biedt, is echter een uitgebreide onderbouwing benodigd waarbij wordt ingegaan op de mogelijke effecten op pathogeniteit, transmissie, virulentie, gastheerbereik en tropisme. Als de onderbouwing niet afdoende is of ontbreekt, volgt een inschaling op ML-III. Bij een complexe aanvraag verzoeken wij u om eerst contact met Bureau GGO genetisch gemodificeerd organisme (genetisch gemodificeerd organisme ) op te nemen over de te volgen procedure.

Voorbeelden:

  • Adenovirus serotype 5 virus (PG2, humaan pathogeen) waarbij uitwisseling met het fiber eiwit van een ander Adenovirus serotype heeft plaatsgevonden (virale sequentie afkomstig van PG2 virus, humaan pathogeen): inschaling via 5.4.3.h op ML-II met verwijzing naar CGM/180316-01.
  • Adenovirus serotype 5 virus (PG2, humaan pathogeen) waarin een CMV promoter (virale sequentie afkomstig van PG2 virus, humaan pathogeen) is gekloneerd voor de expressie van GFP: inschaling via 5.4.3.h op ML-II met verwijzing naar CGM/180316-01.
  • Muizen gammaretrovirus (PG2, strikt dierpathogeen) waarin een CMV promoter (virale sequentie afkomstig van PG2 virus, humaan pathogeen) is gekloneerd voor de expressie van GFP: inschaling via 5.4.3.h op ML-II met verwijzing naar CGM/210218-01.
  • Coronavirus NL63 (PG2, humaan pathogeen) waarbij virale (spike) sequenties van een SARS-CoV-2 (PG3, humaan pathogeen) zijn gekloneerd met een mogelijk effect op pathogeniteit, virulentie of verspreidingskarakteristieken van het PG2 uitgangsvirus: inschaling via 5.4.3.h op ML-III (CGM/210301-01/ CGM/201216-01).
  • Productie van chimeren waarbij Humaan Parechovirus type 1 (PG2, humaan pathogeen) wordt gecombineerd met de structurele genen van Humaan Parechovirus type 2 (PG2, humaan pathogeen): inschaling via 5.4.3.h op ML-III.
    Toelichting: Het valt niet uit te sluiten dat er een chimeer virus ontstaat dat pathogener is dan de uitgangsvirussen (CGM/070115-01).

11. Inschalingsartikel 5.4.3.h: geen effect donorsequenties

Omgang met een aantal veelgebruikte virale sequenties onder 5.4.3.h

  • Immortalisatie van cellijnen door middel van de immortaliserende virale eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T of Ad5 E1A die tot expressie worden gebracht met behulp van de bekende meervoudige plasmiden systemen gebaseerd op muizenretrovirussen of humaan adenovirus (klasse 2) kan via artikel 5.4.3.h op ML-II worden ingeschaald.
  • Toepassing van bepaalde veelgebruikte korte virale sequenties afkomstig van ongeclassificeerde virussen of van klasse 3 en klasse 4 virussen (uitsluitend 2A sequenties, VSV-tag, HA-tag en AU1-tag) als donorsequentie in een klasse 2 virus mag via 5.4.3.h op ML-II worden ingeschaald.

12. Retroviraal vectorsysteem

Retrovirale vectorsystemen onder 5.4.3

Het betreft hier uitsluitend retrovirale vectoren welke vervaardigd zijn met een retroviraal vectorsysteem dat gebaseerd is op de muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide virussen zoals:

  • dl587 rev, Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Murine embryonic stem cell virus (MESV), Murine leukemia virus (MLV), Murine stem cell virus (MSCV), Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV), Spleen focus forming virus (SFFV).

Met een retroviraal vectorsysteem wordt een productiesysteem voor retrovirale vectoren bedoeld; bijvoorbeeld de productie van amphotroop retrovirus door transfectie van de phoenix-Ampho cellijn met de plasmide pLXSN. Bij deze systemen bevat slechts het plasmide met het transgen (de transfervector) het packagingsignaal. De genen gag, pol en env zijn afwezig op de transfervector en worden in trans aangeboden via een of meerdere plasmiden waarvan het packagingsignaal ontbreekt. Veelal wordt gebruik gemaakt van stabiele cellijnen die de genen gag, pol en env tot expressie brengen.

Het gaat hierbij nadrukkelijk niet om handelingen (productie en/of infectie) met de volledige virussen zoals hierboven genoemd. Werkzaamheden met bijvoorbeeld full length MPSV (niet-geclassificeerd) dienen dan ook niet via dit inschalingsartikel ingeschaald te worden, maar dienen via een 2.8 verzoek aangevraagd te worden.