1. Gene drives

Inschalingsartikel 5.0 voor activiteiten met een sequentie specifiek endonuclease die kunnen leiden tot een gene drive

Wat wordt bedoeld met een sequentie-specifiek endonuclease?

Endonucleases knippen onder meer dubbelstrengs DNA (dsDNA). Een voorbeeld van een sequentie-specifiek endonuclease is CRISPR/Cas9. Het Cas9 endonuclease wordt door een gids-RNA naar een specifieke locatie in het genoom geloodst om daar het dsDNA te knippen. De specificiteit voor de knipplaats wordt bepaald door het ‘gids-RNA’.
Andere voorbeelden van sequentie-specifieke endonucleases zijn Zn-finger nucleases en TALENs. In deze endonucleases wordt de knipplaats bepaald door een specifiek eiwitdomein dat veel arbeidsintensiever is om aan te passen dan het gids-RNA van CRISPR/Cas9. Maar ook deze endonucleases kunnen in principe toegepast worden als gene drive.

Wat is een gene drive?

Een gene drive is een genetisch element dat zich in een populatie kan verspreiden met een frequentie die hoger ligt dan de 50% die normaliter bij een Mendeliaanse overerving wordt gevonden. Deze verhoogde frequentie van overerving vindt plaats doordat de gene drive zichzelf kan kopiëren vanaf het ene chromosoom naar het andere zusterchromosoom. Na geslachtelijke voortplanting ontvangen alle nakomelingen een chromosoom met de gene drive. Ook in het genoom van de nakomelingen kan de gene drive zichzelf weer kopiëren naar het zusterchromosoom, waarna alle nakomelingen van de volgende generatie ook de gene drive zullen bevatten. Dit in tegenstelling tot een 'normale'(Mendeliaanse) overerving waarbij  door het ontbreken van het kopieermechanisme de nieuwe eigenschap alleen via het dragerchromosoom  wordt doorgegeven aan nakomelingen en dus veel langzamer binnen een populatie zal verspreiden. Als de nieuwe eigenschap met een gene drive wordt ingebracht, verspreidt deze eigenschap zich binnen een aantal generaties over de hele populatie.

Hoe werkt een gene drive?

Een gene drive bestaat uit sequenties die coderen voor een sequentie-specifiek endonuclease, zoals CRISPR/Cas9, die geflankeerd worden door DNA sequenties die homoloog zijn aan de sequentie rond de knipplaats van het Cas9 in het gastheer genoom (de zgn. gastheer-eigen homologe sequenties). De endonuclease werking van Cas9 zorgt voor een dubbelstrengs breuk in het gastheer DNA, die vervolgens kan worden gerepareerd door een cel-eigen reparatieproces dat homologe recombinatie wordt genoemd. Dit herstelproces heeft tot gevolg dat CRISPR/Cas9 in het chromosoom worden gekopieerd rond de knipplaats van het Cas9.
Vanaf dit chromosoom dat nu de gene drive bezit, wordt het endonuclease opnieuw actief waarbij het op de overeenkomstige locatie in het zusterchromosoom knipt. Ook hier zorgt het reparatie proces van homologe recombinatie er weer voor dat de breuk gedicht wordt waarbij de gene drive sequentie mee gekopieerd wordt. Door deze stap is de gene drive ook in het tweede chromosoom gekopieerd.
Een gedetailleerde uitleg van dit werkingsmechanisme is ook terug te lezen in bijvoorbeeld de publicatie van Gantz en Bier (Science 348(2015): 442-4).

Is een gene drive in elk organisme werkzaam?

Het RIVM beleidsrapport 'Gene drives' (externe link)uit 2015 benoemt een drietal voorwaarden waarin een gene drive effectief is, namelijk in organismen die zich geslachtelijk kunnen voortplanten, die een korte generatietijd hebben en die een efficiënt proces van homologe recombinatie hebben. In de literatuur is de werking van een gene drive al beschreven voor fruitvliegjes, muggen en gistcellen.

Waarom inschaling op niveau IV?

Zorgwekkende eigenschappen van een gene drive zijn dat deze een effect kan hebben op populatie niveau en mogelijk irreversibel is. Organismen met een gene drive (in het kort gdo's) kunnen daarom mogelijk grote effecten hebben op het milieu die om een zorgvuldige afweging vragen voordat deze kunnen worden toegepast.
Om te voorkomen dat een gene drive bij ingeperkt gebruik wordt toegepast zonder dat is vastgesteld en gewaarborgd dat de risico’s van die toepassing verwaarloosbaar klein zijn, is ervoor gekozen een gene drive toepassing in beginsel in het strengste inperkingsniveau te plaatsen. Daarbij wordt de mogelijkheid open gelaten om een minder streng inperkingsniveau aan te vragen via een artikel 2.8 verzoek. In dit verzoek beschrijft u welke werkzaamheden u gaat uitvoeren en onder welke voorwaarden u dit wilt gaan doen. U levert daarbij een risicobeoordeling waarin u onderbouwt welke mogelijke risico’s op welke wijze worden ingeperkt om bij toepassing van een organisme met een gene drive het risico voor mens en milieu als verwaarloosbaar klein te kunnen beschouwen.  Bureau GGO genetisch gemodificeerd organisme (genetisch gemodificeerd organisme ) beoordeelt de veiligheid van deze werkzaamheden en zal al dan niet instemmen met uw verzoek.

Waar vindt u informatie voor het uitvoeren van de risicobeoordeling?

Bijlage 8 van de Regeling ggo geeft een handreiking voor het maken van een risicobeoordeling. Hierbij worden in stap 1 de eigenschappen van de gastheer, de vector en de donorsequentie nader bepaald. In stap 2 worden de activiteiten in kaart gebracht. Aan het einde van stap 2 kunt u het indicatief inperkingsniveau voor het gdo bepalen. Hierbij kunt u gebruik maken van de volgende risicoklassen voor het organisme met een gene drive (het gdo):

  • gdo risicoklasse 1 (inperkingsniveau I): activiteiten met een gdo leiden tot een verwaarloosbaar klein of laag risico voor mens en milieu. Een gdo dat tot deze klasse behoort is in feite een ggo waarbij de verspreiding van een gene drive niet mogelijk is. Denk hierbij aan een gdo dat in het omliggende milieu niet kan overleven.
  • gdo risicoklasse 2 (inperkingsniveau II): activiteiten met een gdo hebben een gemiddeld risico. Hierbij moet gedacht worden aan een activiteit met een gdo dat geen permanent, maar een kortstondig schadelijk effect kan veroorzaken voor mens en milieu. Of indien de oorspronkelijke situatie hersteld kan worden door bijvoorbeeld het omliggende milieu met insecticiden te bespuiten. In geval van een kortstondig risico kan bijvoorbeeld gedacht worden aan een ‘daisy gene drive’, waarbij slechts enkele generaties nakomelingen de gene drive zullen erven.
  • gdo risicoklasse 3 (inperkingsniveau III): activiteiten met een gdo hebben een hoog risico. In dat geval bestaat de kans dat het gdo een permanent schadelijk effect kan veroorzaken door vestiging in het milieu en/of verspreiding van de gene drive aan nakomelingen.

Indien er sprake is van pathogeniteit van een gdo, dan dient u de schadelijke effecten ten gevolge van de pathogeniteit ook mee wegen. Hierdoor kan het inperkingsniveau dat op basis van de gdo risicoklasse is vastgesteld mogelijk lager of hoger worden.
In Hoofdstuk 4 van het RIVM rapport 2018 (externe link)  en in Applied Biosafety (externe link) vindt u een toelichting op de risicobeoordeling en zijn voorbeelden gegeven.

Hoe stelt u vast welke inperkingsmaatregelen nodig zijn?

Voor het vaststellen van adequate inperkingsmaatregelen kunt u gebruik maken van de tabel met minimale inperkingsmaatregelen voor de verschillende gdo klassen die opgenomen is in Bijlage 2 van het RIVM rapport 2018 (externe link) . De inperkingsmaatregelen die volgen uit deze gdo klasse legt u naast de standaardvoorschriften voor de verschillende categorieën van fysische inperking (CFI categorie van fysische inperking (categorie van fysische inperking )’s) zoals die zijn opgenomen in bijlage 9 van de Regeling ggo en u bepaalt welke CFI het meest overeenkomt met de benodigde gdo klasse. Voor de  voorschriften die aanvullend of vervangend zijn op de standaard voorschriften van Bijlage 9 kunt u een ATV verzoek indienen.

Wat is het verschil tussen genome editing met CRISPR/Cas9 en een gene drive?

Veruit de meeste toepassingen van CRISPR/Cas9 betreffen genome (gene) editing. Hierbij wordt CRISPR/Cas9 doorgaans tijdelijk een cel binnengebracht om via een knip in het genoom een mutatie te introduceren. Alleen de mutatie wordt aan de dochtercellen doorgegeven.
CRISPR/Cas9 krijgt de gene drive functionaliteit alleen indien het integreert in of nabij zijn knipplaats. Dit wordt bijvoorbeeld bewerkstelligd door de aanwezigheid van sequenties die homoloog zijn aan de gastheer eigen sequenties rond de knipplaats waardoor integratie van CRISPR/Cas9 in het gastheergenoom mogelijk is via homologe recombinatie. Het is van belang dat de gebruiker van het CRISPR/Cas9 systeem goed op de hoogte is van het verschil tussen het gebruik van CRISPR/Cas9 als genome editing systeem en het gebruik als gene drive. Reguliere genome editing technieken kunnen via de overige inschalingsartikelen van bijlage 5 worden ingeschaald.

Werkzaamheden met CRISPR/Cas9 die niet onder inschalingsartikel 5.0 beoordeeld hoeven te worden.

Er wordt veelvuldig gebruik gemaakt van CRISPR/Cas9. Het is niet zo dat alle activiteiten met CRISPR/Cas9 onder inschalingsartikel 5.0 beoordeeld moeten worden. Activiteiten die er bijvoorbeeld niet onder vallen zijn:

  • transductie van animale cellen (zolang dit geen embryonale stamcellen betreffen) met een retrovirale vector waar op de sequenties coderend voor CRISPR/Cas9 gelegen zijn. Hoewel deze modificatie van de cellen tot integratie van de vector en dus van CRISPR/Cas9 in het gastheergenoom zal leiden, is een gene drive effect uit te sluiten omdat deze cellen geen geslachtelijke voortplanting kunnen ondergaan.
  • toediening van CRISPR/Cas9 in de vorm van eiwit respectievelijk RNA. Omdat geen CRISPR/Cas9 coderende sequenties aan de gastheercel aangeboden worden, is integratie van CRISPR/Cas9 in het genoom niet mogelijk en kan er geen sprake zijn van een gene drive.

2. CRISPR/Cas9

Hoe schaal ik cellen in die met CRISPR/Cas9 zijn of worden gemodificeerd middels genome editing?

Activiteiten met cellijnen die reeds zijn gemodificeerd of worden gemodificeerd met CRISPR/Cas9 kunt u op ML-I inschalen via 5.4.1.i (uitgaande van een niet-schadelijk genproduct als donorsequentie). Dit geldt zowel voor de situatie dat CRISPR/Cas9 via een plasmide in de cel wordt gebracht als voor de situatie dat bijvoorbeeld een Cas9 eiwit / gRNA complex in de cel wordt gebracht. Als de transductie van animale cellen met bijvoorbeeld een retrovirale vector coderend voor CRISPR/Cas9 wordt uitgevoerd, kunt u inschalen via 5.4.3.i. 

Hoe schaal ik micro-organismen in die met CRISPR/Cas9 zijn of worden gemodificeerd middels genome editing?

Activiteiten met micro-organismen die reeds zijn gemodificeerd of worden gemodificeerd met CRISPR/Cas9 kunt u op ML-I inschalen via 5.2.i voor een apathogeen micro-organismen of 5.3.i voor een pathogeen micro-organismen (uitgaande van een niet-schadelijk genproduct als donorsequentie).  

3. Niet-viraal pathogeen

Inschalingslid d: niet-viraal pathogeen van klasse 4, 3 of 2

Om inschalingslid d van toepassing te laten zijn, moet het pathogeen benoemd zijn op één van de lijsten 4.2, 4.3 of 4.4 van Bijlage 4 van de Regeling. Deze lijsten bevatten de classificatie van pathogene bacteriën (4.2), schimmels (4.3) en parasieten (4.4) op basis van hun ziekteverwekkend vermogen voor mens en/of dier.

Indien het pathogeen niet op deze lijst voorkomt moet een risicobeoordeling overeenkomstig bijlage 8 van de Regeling uitgevoerd worden en een artikel 2.8 verzoek worden gedaan om de pathogeniteitsklasse van het pathogeen vast te stellen. Bij deze risicobeoordeling dient aangegeven te worden, met gebruikmaking van de definities van de klassen van micro-organismen, tot welke klasse het betreffende pathogeen behoort.

4. Inschalingsartikel 5.2

Inschalingsartikel 5.2: De samenstellende delen behoren niet tot de groep van inserties zoals bedoeld in bijlage 2 lijst A3. Indien dit wel het geval is dienen die delen beschouwd te worden als donorsequenties

Alle onderdelen van de vector moeten in de risicobeoordeling meegenomen worden om uit te sluiten dat er potentieel schadelijke genproducten of virale sequenties (waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren) in de vector aanwezig zijn. Indien één van de samenstellende delen van deze vector behoort tot de groep van inserties zoals beschreven in bijlage 2 lijst A3, dan mag dit samenstellende deel niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moet deze beoordeeld worden als donorsequentie.

Voorbeeld: een sequentie coderend voor een enzymatische functie betrokken bij transpositie moet beschouwd worden als donorsequentie, en zal, afhankelijk van de context van het ggo, mogelijk gezien worden als schadelijk genproduct.

Inschalingsartikel 5.2: De vector bevat geen virale sequenties, afkomstig van virussen die hogere eukaryoten als gastheer hebben, waardoor de vector als virale vector zou kunnen functioneren. Indien dit wel het geval is, dienen die sequenties beschouwd te worden als donorsequenties

Indien in de vector virale sequenties aanwezig zijn die kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte, voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels, dan mogen deze virale sequenties niet beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone, maar moeten deze beoordeeld worden als donorsequenties. Afhankelijk van de karakterisatie en het al dan niet defect zijn van de virale vector volgt een inschaling volgens 5.2, onder b, c, g of h.

Het aanwezig zijn van virale sequenties die coderen voor een enkel viraal genproduct* of regulatoire sequentie, bijvoorbeeld de aanwezigheid van een CMV promoter, SV40 polyA sequentie, IRES sequentie of het gen coderend voor het VSV-G eiwit, in de vector backbone is toegestaan, omdat dergelijke sequenties op zich niet kunnen leiden tot de vorming van replicons of al dan niet defecte voor eukaryote cellen infectieuze virale partikels. Zodoende mogen deze sequenties wel beschouwd worden als onderdeel van de vector backbone. Wel moeten deze virale sequenties meegenomen worden in de risicobeoordeling indien de vector wordt toegevoegd via bijvoorbeeld transfectie of transductie aan animale cellen die virale sequenties bevatten. In dat geval vindt inschaling plaats via 5.4.2 of 5.4.3.

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als donorsequentie beoordeeld te worden.

5. De interpretatie van animale cellen onder 5.4.1 (en 5.4.2, 5.4.3 en 5.4.4)

Dit inschalingsartikel is van toepassing wanneer animale cellen getransfecteerd worden met plasmide DNA. Voor toepassing van dit inschalingsartikel mogen animale cellen ruimer geïnterpreteerd worden dan enkel en alleen primaire cellen en cellijnen. Ook (delen van) organismen die onder microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd worden, kunnen met behulp van dit artikel ingeschaald worden. Tot op heden is dit inschalingsartikel van toepassing geacht op activiteiten met:

  • weefselplakjes, organen en (primaire) tumoren;
  • eieren van vogels (*);
  • (bevruchte) eicellen en embryo’s van zoogdieren (uitgezonderd mensen), vissen en Xenopus laevis (klauwkikker)(*);
  • volledige organismen: Caenorhabditis elegans (nematode), Haliclona oculata, Haliclona xena, Dysidae avara, Crambe crambe en Ephydatia fluviatilis (sponzen), Nematostella vectensis (zeeanemoon), Macrostomum lignano, Macrostomum hystrix, Macrostomum hystricinum subsp. marinum, Macrostomum pusillum, Isodiametra pulchra en Schmidtea mediterranea (platwormen).

Eicellen, embryo’s en volledige organismen, zoals hierboven beschreven, mogen alleen als animale cel geïnterpreteerd worden indien zij onder vergelijkbare microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd kunnen worden als animale cellen.

Organismen die niet in deze opsomming voorkomen, zijn niet eerder beoordeeld via dit inschalingsartikel en dienen dan ook via een artikel 2.8 verzoek voorgelegd te worden.

(*) Let op! Wanneer de vogeleieren uitkomen, of wanneer de embryo’s niet meer als embryo worden gezien, dan moeten deze op D-I worden ingeschaald!
Wellicht ten overvloede: in alle gevallen gelden de werkvoorschriften voor afval en besmet materiaal, waarbij ervan wordt uitgegaan dat er geen levend ggo-materiaal in het milieu kan komen.

Voor de artikelen 5.4.2, 5.4.3 en 5.4.4 gelden eveneens de bovengenoemde interpretaties, maar daarbij dient bij de risicobeoordeling nadrukkelijk op het risico van ei-breuk te worden ingegaan. Deel II van bijlage 5, onder artikel 5.10.4, geeft daarbij houvast om een voorstel te doen aangaande de eventuele aanvullende voorschriften die men zal toepassen bij dit risico. Bebroede eieren in associatie met micro-organismen die uit (kunnen) komen moeten op DM-niveau worden ingeschaald conform 5.6.3.

6. Transfectie onder 5.4.1

De transfectie van cellen met virale vectoren onder 5.4.1

Artikel 5.4.1 is bedoeld om handelingen met animale cellen en plantencellen in associatie met een plasmide vector of een virale transfervector, die ook als expressievector gebruikt kan worden, in te schalen; e.g. transfectie van animale cellen en plantencellen. Artikel 5.4.1 dient NIET gebruikt te worden indien de productie van virale partikels en virale replicons beoogd wordt. Afhankelijk van de biologische inperking dient de productie van virale partikels en virale replicons ingeschaald te worden volgens artikel 5.4.2 of 5.4.3.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met behulp van een virale transfervector:
Het doel is de expressie van het transgen (eiwit en/of RNA) en NIET de productie van virale partikels of virale replicons. De helper/packaging plasmiden, benodigd voor de productie van virale partikels, worden dan ook niet samen met de virale transfervector getransfecteerd. Wel dient er rekening gehouden te worden met virale sequenties aanwezig in de gastheer en de vector waardoor er mogelijk genetisch gemodificeerd virus kan ontstaan.

Transfectie van cellen met lentivirale transfervector:
Indien de cellen vrij zijn van HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere niet-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.h op ML-I.
Indien de cellen potentieel geïnfecteerd zijn met HIV-1, HIV-2, HTLV-1 en -2, SIV en andere non-humane lentivirussen: inschaling via 5.4.1.g op ML-III (PG3, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent lentivirus kan niet uitgesloten worden).

Transfectie van cellen met muizenretrovirale transfervector:
Inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, een substantieel deel van de cellijnen die voor wetenschappelijk onderzoek worden gebruikt bevatten retrovirussequenties (CGM/131002-01, CGM/131220-01 en CGM/140228-01 (externe link)), hierdoor kan het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent retrovirus niet worden uitgesloten).
Transfectie van retrovirale transfervectoren gebaseerd op de muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen dl587 rev, Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), Murine embryonic stem cell virus (MESV), Murine leukemia virus (MLV), Murine stem cell virus (MSCV), Myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en Spleen focus forming virus (SFFV) mag via 5.4.1.g op ML-II worden ingeschaald.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie met een plasmide dat virale sequenties bevat die coderen voor een enkel viraal genproduct of regulatoire sequentie*:
De cellen in dit voorbeeld zijn vrij van virale sequenties, waardoor er géén al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd kan worden.

Transfectie van cellen met een plasmide dat het GFP gen tot expressie brengt onder controle van een CMV promoter:
Inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd virus geproduceerd worden en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke sequentie aanwezig).

* Indien dit enkele virale genproduct afkomstig is van een virus dat slechts één open reading frame (ORF) bevat, dan dient dit ORF als defect, voor eukaryote cellen infectieus virus via 5.4.3 ingeschaald te worden.

Voorbeeld:

Transfectie van cellen ten behoeve van eiwit en/of RNA expressie. De productie van virale partikels en virale replicons wordt niet beoogd, maar het ontstaan van genetisch gemodificeerd virus kan niet worden uitgesloten als gevolg van de in de cellen aanwezige virale sequenties.

De cellijn COS-7 bevat een onvoldoende gekarakteriseerde hoeveelheid SV40 sequenties en de vorming van genetisch gemodificeerd SV40 kan niet worden uitgesloten wanneer transfecties met plasmiden met een SV40 origin of replication worden toegepast.

· Transfectie van COS-7 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent SV40 kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van COS-1 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (PG2, het ontstaan van defect genetisch gemodificeerd SV40 kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.h op ML-I (er kan defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van HEK293 cellen:

  • plasmide met SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).
  • plasmide zonder SV40 ori: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd SV40 geproduceerd worden).

· Transfectie van (potentieel) EBV positieve cellen:

  • plasmide met EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.g op ML-II (PG2, het ontstaan van genetisch gemodificeerd replicatie competent EBV kan niet uitgesloten worden).
  • plasmide zonder EBNA1/oriP: inschaling via 5.4.1.i op ML-I (er zal geen al dan niet defect genetisch gemodificeerd EBV geproduceerd worden).

NB: Indien in de vector een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct dan kan een hogere inschaling van toepassing zijn (inschaling volgens 5.4.1.f).

7. Endogeen virus onder 5.4.1

Een endogeen virus dat mogelijk aanwezig kan zijn in de gastheercel of -cellijn onder 5.4.1

Bij handelingen met animale en humane cellen en cellijnen in associatie met plasmide vectoren of een virale transfervector dient, naast met de vector en de donorsequentie, rekening te worden gehouden met (de mogelijke) aanwezigheid van (wildtype) virussen en virale sequenties die bij de vervaardiging van de cellijn zijn toegepast of die als besmetting in de cellen aanwezig kunnen zijn. Er dient in de risicoanalyse rekening te worden gehouden met de mogelijkheid van recombinatie en/of complementatie met deze wildtype virussen en/of virale sequenties, waardoor er een recombinant virus kan ontstaan. Op grond van artikel 5.4.1.g leidt dit tot een hogere inschaling en kunnen, afhankelijk van de eigenschappen van het virus, additionele voorschriften op het hogere inperkingsniveau van toepassing zijn.

Voorbeelden: (zie ook CGM/131002-01):

  • Geïmmortaliseerde cellijnen die het Epstein-Barr Virus (EBV) of Simian virus 40 (SV40) bevatten. Bij transfectie van dergelijke cellen (bv. RAJI en COS-7) met plasmiden die respectievelijk een EBV-ori of een SV40-ori bevatten leidt dit tot een ML-II inschaling.
  • Cellen kunnen ook geïmmortaliseerd zijn met delen van virussen, zoals het SV40 large T antigen, de adenovirus E1A sequentie of de Humaan papillomavirus (HPV) Type 16 E6/E7 sequentie, waarvan de aanwezigheid op zich niet tot de vorming van (recombinant) virus kan leiden. Bij transfectie van dergelijke cellen met plasmiden die HPV, SV40 of adenovirale sequenties bevatten leidt dit tot een ML-II inschaling, indien door de combinatie van de in de cel en het plasmide aanwezige sequenties een recombinant virus kan ontstaan.
  • Humane primaire cellen, kunnen wildtype HIV, HTLV of verwante retrovirussen bevatten. Bij transfectie van bijvoorbeeld HIV positieve cellen (of humane primaire cellen waarvan de HIV status onbekend is) met lentivirale transfervectoren leidt dit tot een ML-III inschaling.

NB: Indien in de cellijn of in het plasmide een sequentie aanwezig is die codeert voor een schadelijk genproduct kan, indien deze sequentie kan worden ingebouwd in het recombinante virus, een nog hogere inschaling dan in bovenstaande voorbeelden van toepassing zijn.

Om aanwezigheid van wildtype virussen uit te sluiten kunnen cellen die potentieel met wildtype virus geïnfecteerd zijn, voorafgaand aan de werkzaamheden op de aanwezigheid hiervan worden gecontroleerd. Indien afdoende kan worden aangetoond dat de potentieel geïnfecteerde cellen die worden gehanteerd geen relevante endogene virussen bevatten, kan de aanvrager artikel 5.4.1.h of 5.4.1.i in plaats van 5.4.1.g hanteren.

Lees meer over endogeen virus onder 5.4.2

8. Inschalingsartikel 5.4.4

Activiteiten met al dan niet genetisch gemodificeerde animale cellen dan wel plantencellen al dan niet in associatie met een genetisch gemodificeerd micro-organismen (5.4.4)

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.b en 5.4.4.c?

Onder onderdeel b betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een dier afkomstige cellen. Het dier is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een dier (veelal afkomstig van ongemodificeerde dieren of genetische gemodificeerde ‘transgene’ dieren die op D-I inperkingsniveau worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

NB: Voor toepassing van het inschalingsartikel 5.4.4.b mogen animale cellen ruimer geïnterpreteerd worden dan enkel en alleen primaire cellen en cellijnen. Ook (delen van) organismen die onder microbiologische kweekomstandigheden binnen een ML laboratorium gehanteerd worden, kunnen met behulp van dit artikel ingeschaald worden (zie ook toelichting onder 10).

Onder onderdeel c betreft het cellen afkomstig van dieren die in vivo aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is of het DM-niveau waarop de dieren zijn ingeschaald (zie bijlage 5.6) leidend voor de inschaling van de uit deze dieren afkomstige cellen op ML niveau, of voor cellen afkomstig van dieren in associatie met genetisch gemodificeerde micro-organismen waarbij een eventuele biologische inperking van het micro-organisme niet door het dier is gecomplementeerd, het ML niveau corresponderend met het inperkingsniveau waarop de micro-organismen moeten worden gehanteerd.

Wat is het verschil tussen onderdeel 5.4.4.e en 5.4.4.f?

Onder onderdeel e betreft het activiteiten met genetisch gemodificeerde micro-organismen in associatie met uit een plant afkomstige cellen. De plant is hierbij niet in vivo aan het genetisch gemodificeerde micro-organisme blootgesteld, het betreft dus uitsluitend in vitro activiteiten met cellen afkomstig uit een plant (veelal afkomstig van wildtype planten of planten die op PL-I, PC-I, PKa-I of PKb-I worden gehouden) in associatie met deze genetisch gemodificeerde micro-organismen. Het ML niveau waarop het genetisch gemodificeerde micro-organisme gehanteerd moet worden, zal hier vrijwel altijd leidend zijn voor de inschaling.

Onder onderdeel f betreft het cellen afkomstig van planten die aan het betreffende genetisch gemodificeerde micro-organisme zijn blootgesteld. Hierbij is het inperkingsniveau waarop de planten zijn ingeschaald (zie bijlage 5.5.3) leidend voor de inschaling van de uit deze planten afkomstige cellen op ML niveau.

Hierbij dient er rekening te worden gehouden dat handelingen met planten in associatie met micro-organismen die op ML-II niveau moeten worden gehanteerd in geval van aërogene verspreiding van het micro-organisme (bv. het geval bij toepassing van sporulerende schimmels), conform 5.5.3.c op PCM-III/PKM-III kunnen zijn ingeschaald. Voor cellen afkomstig uit deze planten geldt dus op grond van 5.4.4.f een ML-III inschaling.

De gebruiker kan een artikel 2.8 verzoek doen om met deze op ML-III niveau ingeschaalde cellen te mogen werken op ML-II niveau. Bij dit verzoek dient bijvoorbeeld te worden onderbouwd hoe kruiscontaminatie met klasse 3 genetische gemodificeerde organismen op PCM-III/PKM-III inperkingsniveau is voorkomen.

9. Gesloten eenheden

Handelingen in gesloten eenheden

Bij handelingen in gesloten eenheden is er sprake van inperking bij de bron, dus op organisme niveau. De volgende voorbeelden illustreren wat ermee bedoeld wordt:

  • Een gg micro-organisme in medium in een gesloten kweekbuis dat wordt geïncubeerd in een stoof in AP-I. In dit geval kunnen er geen aërosolen, waarin zich mogelijk ggo’s bevinden, ontstaan en ontsnappen.
  • Voor microscopie op AP-I geldt dat bij monsters op een objectglas het dekglaasje dichtgeseald moet zijn.
  • Een gg dier bevindt zich in een gesloten box of wordt tijdens een experiment tevoren genarcotiseerd in D-I en blijft gedurende de meting onder narcose zodat het niet kan ontsnappen. 

10. Vervaardiging van dieren en dieren in associatie met gg-micro-organismen

Handelingen met animale cellen (ES-cellen/bevruchte oöcyten) die tot dieren leiden

Handelingen met animale cellen op ML-I niveau waarbij homologe recombinatie in ES-cellen wordt toegepast of micro-injectie van DNA in bevruchte oöcyten, leiden in de meeste gevallen tot dieren die op D-I moeten worden gehuisvest (bijlage 5.6). Dieren die vervaardigd zijn met plasmiden waarin virale sequenties of transposons aanwezig zijn, worden mogelijk hoger ingeschaald. Alleen voor de diersoorten genoemd in artikel 5.6.1.a is de manier van huisvesten van de dieren vastgesteld. Voor alle andere genetisch gemodificeerde dieren moet de manier van huisvesten via een artikel 2.8 verzoek voorgelegd worden aan Bureau GGO genetisch gemodificeerd organisme (genetisch gemodificeerd organisme ).

Inschaling van lentiviraal vervaardigde DM-I dieren op D-I  

Activiteiten met dieren (wildtype dieren of gg-dieren conform 5.6.1.a) in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels of lentiviraal getransduceerde cellen die conform de criteria van bijlage 5 afkomstig zijn van ML-I inperkingsniveau worden ingeschaald via 5.6.3.b op DM-I inperkingsniveau. 
Genetisch gemodificeerde dieren die vervaardigd zijn met een genetisch gemodificeerd lentivirus dat conform de criteria van bijlage 5 afkomstig is van ML-I inperkingsniveau worden ingeschaald via 5.6.2.a. op DM-I inperkingsniveau. 
Inschaling op D-I kan middels een 2.8 verzoek worden voorgelegd waarbij u in uw 2.8 verzoek de voorwaarden die noodzakelijk zijn voor inschaling op D-I dient te benoemen. Deze voorwaarden zijn noodzakelijk om afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes in het dier te bereiken zodat er geen uitscheiding van lentivirale deeltjes uit het dier kan plaatsvinden en het afvoeren van afval op D-I inperkingsniveau is toegestaan. Hieronder een opsomming van de voorwaarden die op grond van COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) adviezen worden gehanteerd:

  • Voor dieren in associatie met lentiviraal getransduceerde cellen waarin reeds afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes in de cellen is bereikt dient u de volgende voorwaarden op te nemen in uw 2.8 verzoek:
    • In de cellen is een reductie van het aantal vrije vectordeeltjes gerealiseerd, die minimaal 100 maal hoger is dan de titer van het inoculum. Deze reductiefactor is berekend aan de hand van de titer van het virale inoculum, de kweektijd na transductie, de halfwaardetijd van het virus op basis van het toegepaste envelopeiwit en het aantal wasstappen en inactiverende stappen of er is een wachttijd van 7 dagen na transductie van de cellen gehanteerd.

Bij het toepassen van de formule voor berekening van de reductieratio voor werkzaamheden met lentiviraal getransduceerde animale cellen dient u rekening te houden met de parameters zoals vermeld in het COGEM rapport ‘COGEM report 2020‐01’ en COGEM advies CGM/200507-01. Indien het niet mogelijk is om de reductieratio te berekenen kan een veiligheidsperiode van 7 dagen gehanteerd worden (CGM/210218-01).

  • Voor dieren in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels (of lentiviraal getransduceerde cellen waarin in de kweek nog niet voldoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes is bereikt) dient u de volgende voorwaarden (conform COGEM advies CGM/090331-03) op te nemen in uw 2.8 verzoek:
    • Er is in het dier een reductie van het aantal vrije vectordeeltjes gerealiseerd, die minimaal 100 maal hoger is dan de titer van het inoculum. Deze reductiefactor is berekend aan de hand van de titer van het virale inoculum, de tijd na transductie en de halfwaardetijd van het virus op basis van het toegepaste envelopeiwit; en
    • de dieren zijn na inoculatie met de lentivirale partikels/lentiviraal getransduceerde animale cellen minimaal 14 dagen op DM-I gehuisvest.  

 NB: In in vitro getransduceerde macrofagen en macrofaagachtige cellen kunnen (ook na wasstappen, na 7 dagen kweek, of 14 dagen wachttijd) lentivirale vectordeeltjes intact aanwezig blijven in de cellen of gebonden als antilichaam-virus-complexen op de plasmamembraan. Kadaverafval van D-I dieren in associatie met in vitro  getransduceerde macrofaagachtige cellen dient daarom als DM-I afval te worden afgevoerd, ook indien een afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes is gerealiseerd. Bij invasieve handelingen kunnen daarbij maatregelen vanuit ARBO Arbeidsomstandigheden (Arbeidsomstandigheden)-overwegingen noodzakelijk zijn (CGM/220517-02).

  • Voor dieren die zijn ingeschaald conform 5.6.2.a. op DM-I dient u als voorwaarde op te nemen dat het de nakomelingen (F1 en verder) van de DM-I dieren betreft zoals vermeld in het COGEM advies CGM/090331-03. In geval van F0 dieren dient er een afdoende reductie van het aantal vrije vectordeeltjes te zijn gerealiseerd zoals hierboven aangegeven voor dieren in associatie met genetisch gemodificeerde lentivirale partikels.  

U kunt voor uw 2.8 verzoek een brede verwijzing hanteren zodat u niet bij ieder nieuw ggo-dier een 2.8 verzoek hoeft voor te leggen. Een brede verwijzing houdt in dat u verwijst naar ‘de genetisch gemodificeerde dieren die conform 5.6.1.a op D-I zijn ingeschaald in associatie met de lentiviraal getransduceerde cellen of lentivirale partikels die conform 5.4.2.h en 5.4.2.i op ML-I zijn ingeschaald’. 

11. Opsomming diersoorten

Uitsluitend de in dit inschalingsartikel beschreven diersoorten kunnen via dit inschalingsartikel ingeschaald worden en alleen voor deze dieren is de manier van huisvesten bepaald. Experimenten met andere diersoorten moeten worden voorgelegd via een artikel 2.8 verzoek.

12. Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien en isolator

Filtertopkooien worden voorgeschreven voor de huisvesting van kleine proefdieren (zoals muizen, ratten en cavia’s) in associatie met genetisch gemodificeerde micro-organismen. Kleine proefdieren en sommige grotere proefdieren (zoals fretten) kunnen ook worden gehuisvest in isolatoren. In de praktijk gaat het hier meestal om ggo’s die voor laboratoriumwerkzaamheden zijn ingeschaald op ten hoogste ML-II niveau, die zich aërogeen kunnen verspreiden (zoals adenovirus) of die serieuze ziekteverschijnselen kunnen veroorzaken, waardoor additionele inperking nodig is om verspreiding naar mens en milieu te beperken of te voorkomen. Het concept dat hierbij gehanteerd wordt, is dat elke kooi of isolator een microbiologische eenheid voorstelt die onafhankelijk is van alle andere kooien of isolatoren in de ruimte. Dit betekent feitelijk dat de microbiële inperking plaats vindt op het niveau van de kooi of de isolator en niet op het niveau van de ruimte. De inschaling van de dierexperimenten waarbij ggo’s van klasse 2 worden toegepast zal doorgaans op DM-II plaatsvinden waarbij een filtertopkooi of een isolator wordt voorgeschreven. Voor grotere proefdieren zal het gebruik van filtertopkooien of isolatoren geen optie meer zijn omdat de dieren er niet passend en veilig in gehuisvest kunnen worden. De inschaling van exprimenten met aërogeen verspreidende ggo’s in dergelijke grote proefdieren zal DM-III zijn; hierbij vindt de inperking ten aanzien van het milieu dus plaats op het niveau van de ruimte (e.g. onderdruk en HEPA filter) en worden ten aanzien van de medewerkerbescherming persoonlijke beschermingsmiddelen voorgeschreven.

13. Handelingen met gg-Drosophila

De COGEM commissie genetische modificatie (commissie genetische modificatie ) heeft eerder geadviseerd over werkzaamheden met genetisch gemodificeerde Drosophila melanogaster (CGM/001016-01 en CGM/050215-04). Het overzetten van gg-Drosophila melanogaster stocks valt niet onder het aanvullend voorschrift voor open handelingen zoals bedoeld in deze eerdere COGEM adviezen. Het aanvullend voorschrift dat de gg-vliegen geïmmobiliseerd dienen te worden met behulp van afkoeling of met behulp van CO2 verdoving, betreft open handelingen waarbij er experimenten met de gg-insecten plaatsvindt buiten de kweekcontainers. Bij het overzetten vinden er echter geen experimentele handelingen plaats, slechts het overbrengen van de vliegenstock van de ene naar de andere voedingsbuis. Het overzetten gebeurt snel, binnen enkele seconden, waardoor er nauwelijks ontsnapping plaatsvindt. Deze kortstondige handelingen kunnen als standaard handelingen worden beschouwd.