U bevindt zich op: Home nl Toelichtingen Schadelijk genproduct

Schadelijk genproduct

Definitie schadelijk genproduct

De Regeling ggo geeft onder artikel 2 de volgende definitie voor een schadelijk genproduct:

  • een genproduct dat een mogelijk toxische, carcinogene, allergene, pathogene of immuun-modulerende eigenschap heeft, dan wel
  • een genproduct dat kan bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal, dan wel
  • een genproduct dat tot een antibioticumresistentie kan leiden waardoor de toepassing van medicijnen ter bestrijding van ziekteverwekkers in gevaar wordt gebracht.

Risicobeoordeling van een potentieel schadelijk genproduct

Stap 1: mogelijke schadelijkheid van sequentie vaststellen

De functie van het genproduct en de (potentiele) schadelijkheid van het product moeten omschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

Stap 2: werkzaamheid in nieuwe gastheer vaststellen

Indien een potentieel schadelijke sequentie gekloneerd wordt in een gastheer geldt in principe, ervan uitgaande dat het schadelijke genproduct aanwezig is en werkzaam kan zijn in de gastheer, minimaal een ML-II-k inschaling. Het daadwerkelijk schadelijke effect moet echter nog bepaald worden en is onder andere afhankelijk van de genetische en fysiologische context van de gastheer waarin de sequentie wordt toegepast.

Factoren die behulpzaam kunnen zijn bij het vaststellen of een potentieel schadelijk genproduct in de context van de gastheer ook als schadelijk beoordeeld moet worden, zijn bijvoorbeeld:

  • Herkomst van de sequentie. Het maakt uit of een sequentie afkomstig is van een pathogeen dan wel apathogeen micro-organisme of een hoger organisme. Een apathogeen micro-organisme zal over het algemeen geen schadelijke sequenties bevatten. Terwijl bij het kloneren van sequenties uit een pathogeen micro-organisme altijd rekening gehouden moet worden met de aanwezigheid van schadelijke genproducten. Ook bij het kloneren van sequenties uit bepaalde hogere organismen, zoals een wesp of een kwal, moet er rekening gehouden worden met de aanwezigheid van schadelijke sequenties.
  • De werkzaamheid van het genproduct in de fysiologische achtergrond van de gastheer. Bijvoorbeeld een virulentiefactor afkomstig uit een bepaalde pathogene bacterie zal alleen maar kunnen bijdragen aan de pathogene eigenschappen van de gastheer als de virulentiefactor past in het ‘leefpatroon’ van de gastheer. Of als een genproduct onderdeel is van een pathway, die leidt tot een schadelijk genproduct, dan moeten alle onderdelen van de pathway in het ggo aanwezig zijn om het schadelijke effect gerealiseerd te krijgen.
  • De omstandigheden van de expressie van het genproduct. Bijvoorbeeld, voor een genproduct dat van nature weefselspecifiek tot expressie komt, kan het een groot verschil maken wanneer het tot expressie wordt gebracht onder controle van een promoter die in alle weefsels actief is. Voor een genproduct dat normaliter getimed of na inductie tot expressie komt kan het verschil maken of het onder controle staat van een constitutieve (continue aangeschakelde) promoter. Voor een genomische DNA sequentie afkomstig uit een eukaryoot donororganisme, waarin intronen aanwezig zijn, maakt het uit of de gastheer een prokaryoot of een eukaryoot is. In een prokaryote gastheer zal de sequentie mogelijk niet tot expressie komen, omdat intron splicing in deze gastheer niet kan plaatsvinden.
  • De mate van expressie van het genproduct. De interpretatie van het risico van hoge expressie, of van onbalans van het natuurlijke expressie niveau, moet worden beoordeeld ten opzichte van het niveau van de expressie onder normale omstandigheden.
  • Posttranscriptionele of posttranslationele modificatie. Sommige genproducten krijgen hun fysiologische werking, en daarmee ook hun potentieel schadelijke werking, pas na posttranslationele modificatie, of nadat ze geleid zijn naar het juiste celcompartiment.
  • Interactie met subunits of cofactoren. Indien de schadelijke werking een samenspel is van subunits, is het van belang vast te stellen of deze subunits allen tesamen tot expressie worden gebracht en tot een schadelijk effect kunnen leiden.

Stap 3: schadelijkheid van het ggo voor mens en milieu vaststellen

Nadat is vastgesteld dat een schadelijk genproduct inderdaad werkzaam is in de context van de gastheer dient de schadelijkheid voor mens en milieu van het ggo nog bepaald te worden. Het effect van potentieel schadelijke genproducten kan namelijk ook beperkt zijn tot de gastheer, e.g. het genproduct heeft alleen een direct effect op de gastheer, maar is niet schadelijk voor mens of milieu. Bij het vaststellen van de schadelijkheid voor mens en milieu worden ook het verspreidingsrisico van het desbetreffende ggo en de mogelijke ernst van de effecten veroorzaakt door het schadelijke genproduct bij eventuele verspreiding meegewogen. Daarbij kan aangetekend worden dat deze stap in iedere risicoanalyse uitgevoerd moet worden, ook bij klonering van genproducten die niet onder de definitie van schadelijk genproduct vallen. Hoewel minder voor de hand liggend dan bij de toepassing van schadelijke genproducten kan niet op voorhand worden uitgesloten dat ook onschadelijke, of niet obligaat schadelijke genproducten de eigenschappen van een gastheer kunnen beïnvloeden, waardoor een schadelijk effect voor mens of milieu kan ontstaan.

Voorbeelden:

- Het tot expressie brengen van een toxine zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden vanwege het directe schadelijke effect, bijvoorbeeld het expresseren van een toxine in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II-k op grond van artikel 5.2.f. Indien men een van een toxine afgeleid deeltoxine tot expressie wil brengen, dan zijn er meerdere situaties denkbaar:

  • De aanvrager heeft geen beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is. Er moet in de risicobeoordeling nog steeds van uitgegaan worden dat sprake is van een schadelijk genproduct. Inschaling: ML-II-k op grond van artikel 5.2.f.
  • De aanvrager heeft de beschikking over experimentele gegevens te weten een LD50 waarde waaruit blijkt dat het toxine onschadelijk is voor vertebraten (zie de criteria COGEM voor toxines CGM/050628-01). Inschaling ML-I, op grond van artikel 5.2.i, aangezien het toxine aantoonbaar niet codeert voor een schadelijk genproduct.
  • De aanvrager heeft niet de beschikking over experimentele gegevens waaruit blijkt dat het deeltoxine onschadelijk is, maar baseert dit op een theoretische onderbouwing. Inschaling ML-II-k op grond van artikel 5.2.f, waarbij men een 2.8 verzoek kan indienen voor inschaling op ML-I waarbij onderbouwd dient te worden dat dit deeltoxine geen schadelijke effecten heeft.

- Het tot expressie brengen van allergenen zal doorgaans tot een hogere inschaling van het ggo leiden, vanwege het directe schadelijke effect. Het expresseren van een allergeen in E. coli zal leiden tot inschaling op ML-II-k, op grond van artikel 5.2.f. Klonering van bepaalde allergenen in E. coli kan onder voorwaarden op ML-I plaatsvinden, bijvoorbeeld in de situatie dat het allergeen achter een induceerbare promoter gekloneerd is. In een dergelijk geval kan via een 2.8 verzoek om inschaling op ML-I niveau worden verzocht.

- De inschaling van oncogenen als schadelijk genproduct is sterk context-afhankelijk. Bij klonering in E. coli van een plasmide met een oncogen of bij transfectie van animale cellen met een oncogen bevattend plasmide, wordt het oncogen doorgaans als niet-schadelijk voor mens en milieu beschouwd, omdat het verspreidingsrisico van E. coli en animale cellen al zeer klein is en de kans dat hierdoor het schadelijke effect (tumorvorming) zal optreden verwaarloosbaar is, vanwege de verschillende stappen die voor tumorvorming (o.a. integratie van het oncogen in het genoom gevolgd door mutaties in andere oncogenen) nodig zijn. Dit betekent dus dat in deze context individuele oncogenen niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen (veelal) op ML-I kunnen worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i of 5.4.1.i. In de context van inschaling van pathogene micro-organismen, met name virussen, zal het potentieel schadelijke effect van het oncogen te allen tijde moeten worden meegewogen. Virussen hebben een groter verspreidingsrisico. Bovendien hebben oncogenen de potentie om de pathogeniteit van virussen te beïnvloeden. Klonering van oncogenen in virussen zal dus leiden tot een hogere standaard inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de oncogene donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

NB: Vele genetisch gemodificeerde cellijnen zijn geïmmortaliseerd met behulp van de immortaliserende eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A of hTERT. Cellijnen die op deze manier zijn geïmmortaliseerd en die vervaardigd zijn met behulp van een tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentiviraal systeem kunnen via artikel 5.4.2.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.2.i (in geval van hTERT) direct op ML-II-k worden ingeschaald. Ook geïmmortaliseerde cellijnen vervaardigd met behulp van virale systemen (de genoemde meervoudige plasmiden systemen) gebaseerd op muizenretrovirussen, AAV of humaan adenovirus kunnen via artikel 5.4.3.h (in geval van HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T, Ad5 E1A) of 5.4.3.i (in geval van hTERT) direct op ML-II-k (zonder 2.8 verzoek) worden ingeschaald.

- Bij klonering in E. coli of bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen coderend voor een immuunmodulerend eiwit bevat, is het, evenals bij oncogenen, niet zeer waarschijnlijk dat hierdoor een blijvend schadelijk effect voor mens en milieu zal kunnen optreden. Dit betekent dus dat in deze context immuunmodulerende eiwitten niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen meestal op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.2.i of 5.4.1.i. In een andere context, bij de inschaling van pathogene micro-organismen, zal het potentieel schadelijke effect te allen tijde moeten worden meegewogen. Immuunmodulerende genen hebben de potentie om de virulentie/pathogeniteit van micro-organismen te beïnvloeden. Een bekend voorbeeld is het muizen IL-4 gen (een gen coderend voor een immuunmodulerend cytokine) dat bij klonering in een muizenpokkenvirus tot een verhoogde virulentie leidde. Klonering van immuunmodulerende eiwitten in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i) Indien afdoende is onderbouwd dat de immuunmodulerende donorsequentie in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek  teworden gedaan.

Pathogeniteitsfactoren. Bij transfectie van animale cellen met een plasmide dat een gen coderend voor een enkele pathogeniteitsfactor bevat, is het niet zeer waarschijnlijk dat hierdoor een schadelijk effect voor mens en milieu zal kunnen optreden. Dit betekent dus dat in deze context pathogeniteitsfactoren niet als schadelijk hoeven te worden beschouwd en deze handelingen op ML-I kunnen worden ingeschaald op grond van 5.4.1.i. Ook bij klonering in E. coli zal een individuele pathogeniteitsfactor, met name indien deze normaal gesproken deel uitmaakt van een pathway bestaande uit meerdere componenten, doorgaans niet tot een schadelijk effect kunnen leiden en kan deze via 5.2.i worden ingeschaald. Echter in geval van klonering van een individuele pathogeniteitsfactor die direct de apathogene eigenschappen van E. coli zou kunnen beïnvloeden (gedacht kan worden aan een individueel eiwit dat het tropisme van E. coli verandert of deze invasief maakt voor cellen) dient er via 5.2.f te worden ingeschaald. In de context van pathogene micro-organismen, zal het potentieel schadelijke effect te allen tijde moeten worden meegewogen. Klonering van pathogeniteitsfactoren in pathogene micro-organismen zal dus leiden tot een hogere inschaling (bijvoorbeeld ML-III op grond van artikel 5.4.3.f. in plaats van ML-II-k op grond van artikel 5.4.3.i). Indien afdoende is onderbouwd dat de pathogeniteitsfactor in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert, kan op grond van artikel 5.4.3.f ook direct op ML-II-k worden ingeschaald. Bij twijfel over de juiste inschaling dient eerst een 2.8 verzoek te worden gedaan.

Antibioticumresistentiegenen kunnen schadelijk zijn voor mens of milieu indien de toepassing van medicijnen hierdoor in gevaar wordt gebracht. Dit is doorgaans niet het geval voor kleinschalige handelingen met veelvuldig in de moleculaire biologie toegepaste antibioticum resistentie genen zoals ampicilline (bla), kanamycine en neomycine (npt-I/II) resistentie genen. Deze kunnen bij toepassing in E. coli als onschadelijk worden beschouwd en op ML-I worden ingeschaald, op grond van artikel 5.2.i. Toepassing van antibioticum resistentie genen die coderen voor resistentie tegen klinisch relevante middelen (zoals bijvoorbeeld ESBLs en vancomycine resistentie genen) leiden wel tot een hogere inschaling (ML-II-k of hoger), op grond van artikel 5.2.f.

- Genproducten die kunnen bijdragen aan de verspreiding van ingebracht genetisch materiaal zijn bijvoorbeeld zelfoverdraagbare genetische elementen en transposons. Hierbij kunnen de volgende veelvoorkomende situaties worden onderscheiden:

  • Bij klonering in E. coli K12 wordt een zelfoverdraagbaar genetisch element gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II-k op grond van artikel 5.2.f
  • Bij klonering in E. coli K12 wordt een actief (prokaryoot of eukaryoot) transposon waarbij zich tussen de transposon uiteinden gekloneerd materiaal bevindt gezien als schadelijk, onafhankelijk van het gekloneerde materiaal. Inschaling, ML-II-k op grond van artikel 5.2.f
  • Dit geldt niet voor een inactief transposon, dat bijvoorbeeld zijn transposase heeft verloren. Inschaling bij klonering in E. coli K12, ML-I op grond van artikel 5.2.i
  • Er zijn geen aanwijzingen dat toepassing van zelfoverdraagbare elementen en transposons in een plasmide vector in eukaryote cellen tot horizontale overdracht van genetisch materiaal kan leiden. Inschaling, ML-I op grond van artikel 5.4.1.i
  • Klonering van een actief transposon in een pathogeen micro-organisme van klasse 2 kan op grond van artikel 5.3.f direct op ML-II-k plaatsvinden indien afdoende is onderbouwd dat het transposon in de context van het micro-organisme niet in een schadelijk effect resulteert.

Ook genproducten die niet onder de definitie van een schadelijk genproduct vallen kunnen in een bepaalde context toch een schadelijk effect hebben. Hierbij kan gedacht worden aan sequenties en eiwitten die op zichzelf niet schadelijk zijn maar die wanneer geinsereerd in een micro-organisme het tropisme kunnen veranderen (in geval van virussen) of de invasiviteit voor animale cellen kunnen bevorderen (in geval van bacteriën) en daardoor in potentie de pathogeniteit kunnen beïnvloeden. Dergelijke sequenties kunnen bijvoorbeeld bij transfectie in animale cellen als niet schadelijk worden ingeschaald (ML-I, conform 5.4.1.i), terwijl deze in de context van een bacterie tot een hogere inschaling kunnen leiden (ML-II-k conform 5.2.f of ML-III conform 5.3.f). Bij twijfel over de juiste inschaling dient een 2.8 verzoek te worden ingediend.


Ook aggregerende eiwitten (zoals alpha-synucleïne) moeten als schadelijk genproduct worden ingeschaald.
Zoeken:

Service