U bevindt zich op: Home nl Toelichtingen Biologisch ingeperkt syteem

Inschaling onder bijlage 5, onder 5.4.2 (biologisch ingeperkte systemen)

Biologische inperking houdt in dat het vermogen van een (micro-)organisme om te overleven en te verspreiden in de natuur beperkt is. Het organisme kan deze beperking van nature bezitten, of de beperking kan door middel van mutatie of genetische modificatie zijn bewerkstelligd. Een biologische inperking kan ertoe leiden dat een organisme in zijn oorspronkelijke niche niet kan overleven of niet kan competeren met andere organismen. In andere gevallen kan het organisme vanwege de biologische inperking slechts overleven in een zeer speciale niche die in het ontvangende milieu niet aanwezig is. Case-by-case wordt vastgesteld of een organisme of systeem een relevante biologische inperking bezit, zodat met deze inperking rekening kan worden gehouden in de inschalingsartikelen van bijlage 5.

Inschaling volgens artikel 5.4.2 is slechts toegestaan voor een beperkte groep van biologisch ingeperkte virale systemen. Het betreft de volgende systemen.

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 2, die beschouwd worden als klasse 1:

  1. baculovirus met p10-deletie of met polyhedrine-deletie;
  2. modified vacciniavirus Ankara (MVA) en vacciniavirus NYVAC;
  3. kanariepokkenvirus ALVAC en kippenpokkenvirus TROVAC;
  4. van Semliki-forest virus (SFV) afgeleide replicons waarbij het genetisch gemodificeerde replicon is geproduceerd met behulp van een meervoudig plasmiden systeem.

NB: uitsluitend het uit drie vectoren bestaande SFV replicon systeem bestaande uit de vector pSFV3 (bevat de niet-structurele genen van SFV) en de twee helper plasmiden, pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2, is tot nu toe als biologisch ingeperkt beoordeeld. De helper plasmiden pSFV-helper-C en pSFV-helper-S2 bevatten respectievelijk de genen coderend voor het capside eiwit en de envelop eiwitten van SFV. In het capside gen is de autoprotease activiteit verwijderd door mutatie van drie nucleotiden resulterend in een serine-alanine mutatie. Overige SFV replicon systemen dienen via 5.4.3 te worden ingeschaald.

Voorbeeld:

  • Handelingen met MVA, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.i op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.
  • Handelingen met MVA, waarbij een enkel viraal gen coderend voor een (antigeen) HPV eiwit gekloneerd is in het MVA genoom: inschaling via 5.4.2.h op ML-I. Toelichting: MVA is een biologisch ingeperkte variant van het vacciniavirus (PG2 virus) en de in de gastheer gebrachte virale sequentie (afkomstig van een PG2 virus) kan niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes).

Biologisch ingeperkte systemen gebaseerd op virussen van klasse 3, die beschouwd worden als klasse 2:

  1. Influenza stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 die zijn vervaardigd middels recombinant DNA technieken;
  2. afgeleiden van deze stammen waarbij minimaal 6 genoomsegmenten afkomstig zijn van deze stammen en twee heterologe gensegmenten van andere Influenza A stammen. Daarbij geldt voor heterologe HA-coderende gensegmenten dat de aanwezigheid van een basische klievingsplaats is uitgesloten;
  3. lentivirus dat wordt vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem.

NB. Inschalingsartikel 5.4.2 mag niet worden toegepast als door de combinatie van gastheercel, virale vector en/of donorsequentie de inperking van het systeem wordt opgeheven (gecomplementeerd).

Toelichting inschaling 2de en 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem onder 5.4.2 en inschaling andere lentivirale systemen onder 5.4.3.

Voor de productie van de lentivirale vectoren worden de verschillende virusfuncties opgesplitst en over tenminste drie vectoren verdeeld (zie Tabel 1). Door deze opsplitsing moet de productie van replicatiecompetent lentivirus (RCL) voorkomen worden. De drie of meer vectoren zijn:

  1. de ‘transfervector’. Dit construct bevat het gewenste transgen, geflankeerd door virale LTRs. Het bevat ook het packaging signaal, zodat het transgen in de virusdeeltjes wordt ingepakt. In verschillende systemen (zie Tabel 1) is sprake van een transfervector waarbij uit de 3’LTR sequentie de promoter en enhancer sequenties zijn verwijderd resulterend in een ‘selfinactivating’ (SIN) vector.
  2. de ‘pseudotyping vector’. Dit is een expressievector voor een envelop eiwit. Meestal wordt het VSV-G gebruikt, waardoor de resulterende lentivirale vector een veel breder spectrum van doelwitcellen kan infecteren, dan HIV-1. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreken in deze constructen.
  3. het ‘packagingconstruct’. Dit plasmide (of set van plasmiden) bevat de HIV-1 eiwitten, die nodig zijn voor virusproductie. Gag en Pol zijn de minimale componenten, maar daarnaast kunnen ook regulatoire en/of accessoire eiwitten aanwezig zijn. Het packagingsignaal en de LTRs ontbreekt in dit construct.

De meest toegepaste lentivirale systemen staan in onderstaande Tabel 1 vermeld met hun specifieke eigenschappen.

Tabel 1: Overzicht lentivirale systemen

2e generatie SIN

3e generatie SIN

Lenti-X

Translenti

SIN (deletie 3’LTR)

Ja

Ja

Nee

Ja

# plasmiden

3

4

6

6

# packaging plasmiden

1

2

3

3

Accesoire genen

Vif, vpr, vpu, nef

_

_

vpr

vpr

# plasmiden

met 

 

Tat aanwezig

 

Rev aanwezig

1

 

 

+

+

1

 

 

-

+

2

 

 

+

+

2

 

 

+

+

# recombinaties nodig voor RCL

3

4

4

4

envelop

VSV-G

VSV-G

VSV-G

VSV-G

Standaard inschaling volgens

5.4.2

5.4.2

5.4.3

5.4.3

Inperking

ML-II-k

ML-II-k

 

ML-III

ML-III

In de Regeling worden uitsluitend lentivirale partikels die worden vervaardigd met een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem als biologisch ingeperkt beschouwd. De 2de en 3de generatie SIN lentivirale vectorsystemen moeten voldoen aan de definities zoals vermeld in artikel 2 van de Regeling. Uitsluitend 2de en 3de generatie SIN lentivirale vectorsystemen waarin voor de pseudotypering gebruik wordt gemaakt van een apart plasmide coderend voor het VSV-G eiwit en die voldoen aan de verdere specificaties zoals vermeld in tabel 1 worden in de Regeling als biologisch ingeperkt beschouwd en worden ingeschaald onder 5.4.2.

Lentivirale systemen die niet voldoen aan de bovenvermelde definitie van het 2de en 3de generatie SIN lentiviraal vectorsysteem (bv. het lenti-X systeem en het translenti systeem, Tabel 1) worden onder artikel 5.4.3 ingeschaald en moeten case-by-case via een artikel 2.8 verzoek langskomen voor een eventuele lagere inschaling op basis van hun biologische inperking. Hier is voor gekozen omdat de ervaring heeft geleerd dat (combinaties van) deze systemen vaak foutief worden ingeschaald op een te laag niveau.

NB: Voor alle in de tabel vermelde systemen geldt dat indien voor de pseudotypering gebruik wordt gemaakt van het reguliere plasmide coderend voor het VSV-G eiwit (en indien verder geen heterologe virale sequenties in de transfervector aanwezig zijn) de inschaling moet plaatsvinden onder 5.4.2.i (in geval van een 2de of 3de generatie SIN lentiviraal systeem) of 5.4.3.i (overige in Tabel 1 vermelde systemen). Er wordt in dit geval vanuit gegaan dat bij de productie van de partikels geen chimeer virus kan worden gevormd. 

Voorbeeld:

Inschaling 2de of 3de generatie SIN lentiviraal systeem:
Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een humane promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.i op ML-II-k. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een CMV promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.2.h op ML-II-k . Toelichting: het systeem gebaseerd op PG3 virus (lenti) is biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG2 virus (CMV)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Inschaling lenti-X lentiviraal systeem:
Productie van lenti-X lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een humane promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt (staat niet in 5.4.2) en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van lenti-X lentivirale partikels, waarbij het GFP gen gekloneerd is achter een CMV promoter in de transfervector: inschaling via 5.4.3.h op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (CMV promoter afkomstig van een PG2 virus) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Via een artikel 2.8 verzoek kan beargumenteerd worden aangegeven waarom de voorgaande drie voorbeelden als biologisch ingeperkt beschouwd kunnen worden en op een lager inperkingsniveau gehanteerd kunnen worden.

Inschaling combinatie van lentivirale systemen:
Productie van lentivirale partikels, waarbij een lenti-X transfer vector, waarin het GFP gen is gekloneerd, wordt gecombineerd met 3de generatie lentivirale packaging vectoren: inschaling via 5.4.3.i op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (lenti) is niet voldoende biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Omgang met een aantal veelgebruikte virale sequenties:

  • Immortalisatie van cellijnen door middel van de immortaliserende virale eiwitten HPV(16/18) E6/E7, SV40 largeT, polyoma middle T of Ad5 E1A die tot expressie worden gebracht met behulp van 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels kan via artikel 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.
  • Toepassing van bepaalde veelgebruikte korte virale sequenties afkomstig van ongeclassificeerde virussen of van klasse 3 en klasse 4 virussen (uitsluitend 2A sequenties, VSV-tag, HA-tag en AU-1 tag) als donorsequentie in 2de of 3de generatie SIN lentivirale partikels mag via 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.
  • Productie van tweede generatie SIN of derde generatie SIN lentivirale partikels, waarbij sprake is van regulatoire sequenties afkomstig van muizen gammaretrovirussen en hiervan afgeleide (ongeclassificeerde) virussen (Murine leukemia virus (MLV), murine embryonic stem cell virus (MESV), Moloney murine sarcoma virus (MoMSV), myeloproliferative sarcoma virus (MPSV), murine stem cell virus (MSCV), spleen focus forming virus (SFFV), PCC4-cell passaged myeloproliferative sarcoma virus (PCMV) en dl587 rev) in de transfervector: mag via 5.4.2.h op ML-II-k worden ingeschaald.

Toelichting inschaling influenza A stammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 onder 5.4.2 en inschaling andere influenza A stammen onder 5.4.3.

Voor ggo activiteiten worden influenza A virussen standaard ingedeeld in pathogeniteitsklasse 3. Deze classificatie houdt in dat ggo activiteiten met de meeste influenza A virussen conform bijlage 5.4.3 minimaal ingeschaald worden op ML-III. De laagpathogene geattenueerde laboratoriumstammen A/PR/8/34 en A/WSN/33 vormen hierop een uitzondering, deze worden als biologisch ingeperkt beschouwd. Van beide virusstammen is bekend dat ze niet virulent en sterk geattenueerd zijn voor mensen, waardoor deze stammen conform artikel 5.4.2 kunnen worden toegepast op ML-II inperkingsniveau. Tevens worden chimere influenza virussen die zijn samengesteld uit 6 of 7 genoomsegmenten van A/PR/8/34 of A/WSN/33 en 1 of 2 heterologe genoomsegmenten (bv. HA of NA) van andere wildtype influenza A virussen afkomstig van mens of dier, met uitzondering van de 1918 virusstam, als biologisch ingeperkt beschouwd. Andere (al dan niet chimere) laagpathogene influenza A stammen worden standaard onder artikel 5.4.3 ingeschaald en moeten case-by-case via een artikel 2.8 verzoek langskomen voor een eventuele lagere inschaling.

Voorbeeld:
Productie van A/PR/8/34, waarbij het GFP gen gekloneerd is in het virus achter een endogene promoter: inschaling via 5.4.2.i op ML-II-k. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) is biologisch ingeperkt en er is een gekarakteriseerde, onschadelijke donorsequentie (GFP) aanwezig.

Productie van A/PR/8/34, met heterologe HA en NA genoomsegmenten van een andere influenza A virusstam: inschaling via 5.4.2.h op ML-II-k (het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) is biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG3 virus (influenza A)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Productie van een vaccinstam gebaseerd op 6 gen segmenten van een influenza A stam niet vermeld onder 5.4.2, met heterologe HA en NA genoomsegmenten van een andere influenza A virusstam: inschaling via 5.4.3.h op ML-III. Toelichting: het systeem gebaseerd op een PG3 virus (influenza A) wordt in de Regeling niet gezien als biologisch ingeperkt en de in de gastheer gebrachte virale sequenties (afkomstig van een PG3 virus (influenza A)) kunnen niet leiden tot de vorming van autonoom replicerende virusdeeltjes.

Via een artikel 2.8 verzoek kan eventueel beargumenteerd worden waarom de stam als biologisch ingeperkt beschouwd kan worden en op een lager inperkingsniveau gehanteerd kan worden.

 

 

Zoeken:

Service