U bevindt zich op: Home nl Toelichtingen (On)gekarakteriseerde ds

Gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties

Toelichting gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties

In de inschalingsartikelen van bijlage 5 wordt gesproken over gekarakteriseerde en ongekarakteriseerde donorsequenties. In Bijlage 2, lijst A3 onder punt 1 wordt beschreven wanneer een sequentie in ieder geval als ongekarakteriseerd beschouwd moet worden.

Een sequentie wordt in ieder geval beschouwd als ongekarakteriseerd indien een of meerdere van de hierna genoemde gegevens ontbreken:

  1. de herkomst en de aard van de sequenties;
  2. de wijze waarop de insertie is geconstrueerd;
  3. een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben.

Aandachtspunten bij de onderbouwing bedoeld onder c, zijn de functie en de relatieve posities van

  • structurele genen,
  • regulerende sequenties,
  • synthetische sequenties,
  • van transposons en provirussen afgeleide sequenties en
  • sequenties die van belang zijn voor de replicatie in het genetisch gemodificeerde organisme.

a.     De herkomst en de aard van de sequenties

De herkomst, dus de donor waaruit de sequenties gekloneerd worden, moet bekend zijn en omschreven worden, ongeacht of het een hoger organisme of een micro-organisme betreft. Indien de donor een niet viraal (a)pathogeen (een bacterie, schimmel of parasiet) is, dan moet deze vermeld staan op bijlage 2, lijst A1 of op één van de lijsten van bijlage 4, lijst 4.2, 4.3 of 4.4. In geval van een viraal pathogeen moet deze vermeld staan op bijlage 4, lijst 4.1. Als het micro-organisme niet op één van de bijlagen vermeld staat, dan moet de gebruiker een artikel 2.8 verzoek doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen.
Verder moet de aard van de sequenties beschreven worden, hierbij gaat het om wat voor soort sequenties het betreft, is het bijvoorbeeld een genomische sequentie, een cDNA bank, een specifiek gen, een synthetische sequentie of een gedeelte van de coderende sequentie van een gen.

b.    de wijze waarop de insertie is geconstrueerd

De manier waarop de sequenties gekloneerd zijn of gaan worden moet omschreven worden, aangezien dit voor de inschaling bepalend kan zijn. Worden sequenties random gekloneerd uit bekende donoren of juist uit een pool van (on)bekende donoren? Wordt met aspecifieke primers gezocht of wordt met specifieke primers naar een specifiek gen gezocht en wordt uitsluitend dit specifieke gen gekloneerd? Worden uitsluitend korte sequenties (bijvoorbeeld domeinen of delen van genen) of ook langere sequenties (complete genen) gekloneerd?

c.     een onderbouwing van welke functie of functies de sequentie kan hebben

De functie(s) die een sequentie kan hebben, moet(en) beschreven worden. De functie(s) kunnen beschreven worden met gebruikmaking van (vak)literatuur. Alternatief kunnen de functie(s) vastgesteld worden middels bio-informatische analyse en/of door middel van het genereren van experimentele gegevens. De op deze manier vastgestelde functie(s) moeten bij de risicobeoordeling meegenomen worden.

Om in de risicobeoordeling een sequentie als gekarakteriseerd te kunnen beschouwen moet op nucleotide niveau vastgesteld zijn dat het daadwerkelijk de beoogde sequentie betreft en moet van deze sequentie beargumenteerd worden welke functie(s) de sequentie heeft. Het is dus van belang op te merken dat een fragment waarvan alleen de nucleotide sequentie is vastgesteld niet per definitie als gekarakteriseerd is te beschouwen. De gegevens over functie en herkomst moeten immers ook geleverd worden.

Vaststellen van de identiteit van een sequentie

Het vaststellen van de identiteit van de beoogde sequentie op nucleotide niveau kan op verschillende manieren uitgevoerd worden en is afhankelijk van het uitgangsmateriaal.

  • Wanneer er random gekloneerd wordt, is er in eerste instantie altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties en moet er ingeschaald worden via a t/m e, daarbij rekening houdend met eventuele aanwezigheid van potentieel schadelijke genproducten en de wijze van klonering.
  • Als er een cDNA bank gemaakt wordt in E. coli is er altijd sprake van ongekarakteriseerde sequenties. Vervolgens kan er op zoek gegaan worden naar specifieke sequenties waarvan de functie bekend is. Dit kan op verschillende manieren, afhankelijk van wat er al bekend is van de sequentie: met specifieke primers, door te sequencen, door restictie-enzym analyse, western blot of met functionele enzymatisch bepalingen. Indien de herkomst, aard en functie van het gekloneerde gen afdoende is bewezen is er sprake van een gekarakteriseerde sequentie en kan er ingeschaald worden volgens f t/m i.
  • Wanneer uit een pool van random sequenties een specifiek gen gekloneerd gaat worden, waarvan de sequentie en functie bekend zijn, kan met specifieke nested primers een specifiek PCR fragment gegenereerd worden. Nadat de identiteit van dat fragment met een gevalideerde methode bevestigd is, bijvoorbeeld door sequentie analyse of restrictie enzym analyse in combinatie met de grootte van het fragment, mag er van een gekarakteriseerde sequentie uitgegaan worden.
  • Indien een bekende sequentie van derden is verkregen, dan kan de identiteit van de sequentie (de reinheid) vastgesteld worden met behulp van restrictie-enzym analyse aangezien het hier een secondaire karakterisering betreft.

Voorbeelden:

  1. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis (klasse 3) waarbij complete genen zijn geamplificeerd middels RT-PCR. Inschaling ML-II-k via 5.2.a.
  2. Random klonering in E. coli K12 van genproducten uit Mycobacterium tuberculosis waarbij korte sequenties van ten hoogste 50 bp (doel: amplificatie van korte antigene en merker sequenties) worden gekloneerd. Inschaling ML-II-k via 5.2.d aangezien door de beperkte grootte van de fragmenten er geen schadelijke genproducten gekloneerd zullen worden. Via een 2.8 verzoek kan om lagere inschaling worden gevraagd. Hierbij dient een onderbouwing geleverd te worden waarbij bijvoorbeeld de gevolgde wijze van klonering en eventueel gevolgde karakterisatie stappen betrokken worden. 
  3. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij antibioticumresistentie tegen klinisch relevante middelen uit E. coli in Salmonella typhimurium (klasse 2), waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-III via 5.3.f.
  4. Klonering met specifieke nested primers van een bekend gen betrokken bij vetzuurmetabolisme (zonder schadelijke eigenschappen) uit Mycobacterium tuberculosis, in Salmonella typhimurium (klasse 2) waarbij alvorens te kloneren de identiteit van de sequentie door sequentie- of restrictieanalyse is bevestigd. Inschaling ML-II-k via 5.3.i.

Hoe moet nu bij de risicobeoordeling omgegaan worden met gekarakteriseerde dan wel ongekarakteriseerde sequenties in combinatie met een potentieel schadelijk genproduct?

In de inschalingsartikelen van bijlage 5, onder 5.2 t/m 5.4.3 is er voor de inschaling van alle activiteiten een onderverdeling gemaakt in gekarakteriseerde sequenties (f t/m i) en ongekarakteriseerde sequenties (a t/m e).

Gekarakteriseerde sequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen f t/m i is er sprake van activiteiten met gekarakteriseerde sequenties en zijn de eigenschappen van de sequentie bepalend voor de inschaling. Als het virale sequenties betreft wordt ingeschaald onder g of h (NB. enkelvoudige virale sequenties kunnen indien voldoende gekarakteriseerd onder 5.2, 5.3 en 5.4.1 ook onder i. worden ingeschaald). Zijn het niet-virale, potentieel schadelijke sequenties afkomstig van micro-organismen of hogere organismen dan moet ingeschaald worden volgens f. Als de sequenties voldoen aan de criteria van bijlage 2, lijst A3 en dus onschadelijk zijn, dan kan er ingeschaald worden via i.

Ongekarakteriseerde donorsequenties en schadelijk genproduct

Onder de inschalingsartikelen a t/m e is er sprake van activiteiten met ongekarakteriseerde sequenties die afkomstig zijn van een donor of van verschillende donoren waarbij de aard en de functie van de sequenties nog niet bepaald is. Daarmee zijn de eigenschappen van de donor bepalend voor de inschaling.

Het is bekend dat veel niet-virale pathogenen schadelijke sequenties bevatten. In dat geval dient er voor ongekarakteriseerde sequenties ingeschaald te worden volgens a, aangezien niet uitgesloten kan worden dat het mogelijk een schadelijk genproduct betreft. Indien door de werkwijze uitgesloten wordt dat schadelijke sequenties gekloneerd worden uit niet-virale pathogenen van klasse 2 of 3 die al dan niet schadelijke sequenties bevatten, dan kan ingeschaald worden volgens d.

Als deze sequenties afkomstig zijn van virale donoren dan dient ingeschaald te worden onder b (in geval van een voor eukaryote cellen infectieus virus) of c (in geval van een defect, voor eukaryote cellen infectieus virus). In het geval van virale sequenties is de classificatie van het virus waaruit de sequentie afkomstig is bepalend voor de inschaling van de sequentie. Indien het om een onbekend of niet geclassificeerd virus gaat, dient men altijd een artikel 2.8 verzoek te doen om de pathogeniteitsklasse te laten vaststellen. 

Als de donor een hoger organisme is en geen schadelijke genproducten bevat, dan kan via e ingeschaald worden. Echter, ook bij hogere organismen kan niet in alle gevallen uitgesloten worden dat er toch schadelijke genproducten aanwezig zijn en gekloneerd worden. Dit is met name het geval bij verrijking van (potentieel) schadelijke sequenties gedurende het kloneringsproces. In een dergelijk geval bestaat de mogelijkheid dat bij ongekarakteriseerde sequenties van hogere organismen toch via a moet worden ingeschaald.

Voorbeelden:

  1. Wanneer een genomische of cDNA bank van land- en tuinbouwgewassen gekloneerd wordt in E. coli K12 dan kan via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald. Land- en tuinbouwgewassen worden beschouwd als veilig, hoewel het bekend is dat ze wel toxische stoffen kunnen bevatten, maar die zijn het resultaat van een hele reeks van genen die onderdeel zijn van een pathway. Alleen wanneer het doel van de experimenten is om de complete pathway te kloneren en tot expressie te brengen in een nieuwe gastheer moet er via 5.2.a op ML-II-k ingeschaald worden.
  2. Ook genomische of cDNA banken van zoogdieren of de mens welke gekloneerd worden in E. coli K12 kunnen via 5.2.e op ML-I worden ingeschaald, ondanks dat het DNA mogelijk transposons, sequenties coderend voor aggregerende eiwitten die geassocieerd zijn met pathogene effecten (zoals bv. prionen) of virale sequenties bevat. Alleen als men dit soort genen actief opzoekt dan wel gaat verrijken, dient er te worden ingeschaald via 5.2.a op ML-II-k uitgaande van de (potentiële) schadelijkheid van deze genproducten of via 5.2.b. of 5.2.c. in geval van virale sequenties.
  3. Wanneer een genomische of cDNA bank van micro-organismen die voorkomen in grondmonsters gekloneerd wordt in E. coli K12 dan moet er vanuit gegaan worden dat een mengsel van al het genetisch materiaal van de potentieel aanwezige micro-organismen in de grond gekloneerd wordt. In de grond komen namelijk ook pathogene micro-organismen voor die schadelijke sequenties bevatten. Daarom moet er bij de risicobeoordeling van uitgegaan worden dat iedere sequentie van alle aanwezige micro-organismen gekloneerd kan zijn en dus wordt bij de risicobeoordeling ingeschaald volgens inschalingsartikel 5.2.a ‘de donor bevat een schadelijk genproduct dat werkzaam kan zijn in de gastheer’.

Bovenstaande voorbeelden zijn van toepassing op artikel 5.2. Voor de inschaling van ongekarakteriseerde sequenties via 5.3 en 5.4 kunnen veelal soortgelijke redeneringen toegepast worden. Er dient bij de inschaling echter altijd rekening gehouden te worden met de context van het ggo waarin het genproduct gekloneerd wordt. Ter illustratie: een genproduct coderend voor een immuunmodulerend eiwit dat onschadelijk is bij klonering in een apathogene E. coli K12 stam zou in de context van een ander ggo, bijvoorbeeld een pathogeen virus of een pathogene bacterie, wel degelijk schadelijk kunnen zijn. In dat geval wordt dus hetzelfde genproduct als onschadelijk beschouwd bij inschaling via 5.2 en als schadelijk beschouwd bij inschaling via 5.3 of 5.4.

 

Zoeken:

Service